江蘇高效內毒素檢測方法驗證

來源：發布時間：2025-10-12

內毒素檢測中，樣品中的蛋白質或酶的修飾作用易破壞鱟試劑的反應體系，導致檢測結果失真。鱟試劑檢測內毒素的本質是一系列絲氨酸蛋白酶的酶促放大過程，若樣品中存在氧化劑、抗氧化劑、蛋白水解劑或專一失活劑，會直接滅活反應所需的酶；而乙醇、苯酚等物質則會導致蛋白質變性，同樣抑制反應進程。例如，某些生物制品中含有的蛋白水解酶，可能提前降解鱟試劑中的蛋白酶，使內毒素無法被正常檢測。為消除這類干擾，需優先限制樣品中抑制物的含量：可采用內毒素檢查用水稀釋樣品，降低抑制物濃度；對耐熱的抑制物（如部分蛋白水解酶），可通過加熱滅活處理（如 56℃孵育 30 分鐘）破壞其活性；若樣品基質復雜，還可使用超濾技術分離內毒素與干擾蛋白質，避免修飾作用對酶促反應的影響，保障內毒素檢測結果的可靠性。

內毒素檢測方法多樣，影響因素及實驗干擾較多，包括實驗操作步驟、樣品處理等方面。江蘇高效內毒素檢測方法驗證

血液制品（如白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子）來源于人血漿，內毒素污染風險高，且基質中含大量蛋白質、脂質等干擾物質，檢測難度較大。傳統 LAL 法易受血漿蛋白抑制，需通過預處理去除干擾：如采用三氯乙酸沉淀蛋白、超速離心分離脂質，或使用特定去干擾試劑（如內毒素提取試劑）。此外，血液制品內毒素限值較低，需選用高靈敏度檢測方法（如動態顯色法，LOD=0.005 EU/mL）。檢測過程中需嚴格區分 “內源性內毒素”（血漿中天然存在）與 “外源性污染”，通過工藝優化（如巴氏滅活、納米膜過濾）降低外源性內毒素殘留，保障臨床用藥安全。

北京原料藥內毒素檢測常見問題分析繪制內毒素標準曲線時，起始濃度需統一為 1000EU/mL，避免稀釋誤差。

檢測細菌內毒素的堂試劑方法，是一個生物反應過程，受到很多因素的干擾。在一個供試品的檢測方法固定下來之前，為了得到準確的結果，必須要了解供試品與鱟試劑之間的相互關系。供試品中的成分往往非常復雜，而且會干擾試驗檢測系統的功能。很多干擾的機理，并不是非常清楚。但是業界比較能夠接受的理論是，如果供試品中某些因子影響了鱟試劑中蛋白的表達功能，則被認為是干擾作用（Inhibition/Enhancement，V/E）。干擾作用產生的因素較多，一般包括試劑因素（鱟試劑、內毒素標準品）供試品因素（pH值、溫度、離子強度、濃度、水溶性、黏度、可發生鱟試劑反應的非內毒素雜質）和實驗因素（試驗器皿、細菌內毒素檢查用水、鱟試劑抗干擾能力）等。

醫療器械（如輸液器、注射器、植入式設備）若攜帶內毒素，可能通過血液、組織接觸引發異常反應或炎癥反應。其檢測需遵循 “模擬臨床使用” 原則：采用浸提液（如 0.9% 氯化鈉溶液或注射用水）在 37℃±1℃下浸提器械表面內毒素，再通過 LAL 或 rFC 法檢測浸提液。不同器械的內毒素限值差異明顯：一次性輸液器需≤0.5 EU/device，植入式心臟瓣膜則要求更嚴格（≤0.06 EU/device）。檢測時需注意器械材質對浸提效率的影響，如塑料類器械可能吸附內毒素，需優化浸提時間（通常≥1 小時）或采用超聲輔助提取，確保殘留內毒素被充分檢出。

細菌內毒素檢測中，rCR 對高蛋白（如單抗、FBS）、細胞培養上清等特殊樣本適配性好。

當實驗室更換內毒素檢測方法或更換試劑供應商時，需進行方法比對與橋接驗證。比對實驗需選取至少 3批代表性樣品，分別用新舊方法檢測，計算結果相關性（如相關系數 R2≥0.95）和偏差（≤20%）。橋接驗證還需評估新方法的特異性、靈敏度是否與舊方法一致，如確認對高風險樣品（如含 β- 葡聚糖的樣品）的抗干擾能力相當。若方法變更涉及法規申報產品，需將驗證數據納入申報資料，證明變更后方法仍能有效控制內毒素風險，符合 FDA、NMPA 等監管機構對方法變更的合規性要求。

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內毒素指示劑（ECV）是凍干脂多糖，監測制藥工藝高溫除內毒素效果。江蘇高效內毒素檢測方法驗證

如何準備樣品進行內毒素檢測呢？測試前，需要根據樣品實際情況進行樣本前處理。大多數樣品只需要稀釋，使用內毒素檢測試劑盒進行測試即可。如果樣品有蛋白酶干擾并導致假陽性結果，建議對樣品稀釋并70°C加熱5-15分鐘進行熱滅活處理。如需要，可以對滅活樣品進行進一步稀釋后檢測。如果樣品可能含有受β-葡聚糖，建議使用抗增液。β-葡聚糖可能來自酵母和纖維素材料。如果樣品中因含有內毒素結合物而存在抑制，可以嘗試使用分散劑。

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