實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）通過在普通 PCR 反應體系中加入了熒光標記探針或熒光染料，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物變化。通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。具有專一性更高、可實時監控、可重復精確定量等優勢。qPCR的種類根據qPCR的化學發光原理一般分為2大類：一類是探針法，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加；一類是基于SYBR Green I 的染料法，通過熒光染料來指示產物的增加。qPCR實現了通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。湛江qPCR儀消毒

交聯和裂解——穩定復合物并分離核組分:第一步對時間要求嚴格并且需要優化。體內共價交聯穩定蛋白質-DNA相互作用并于特定時間點進行分析。通常采用甲醛交聯，加入甘氨酸以終止反應。交聯劑滲透到完整細胞中并將蛋白質-DNA復合物鎖定在一起從而進行分析。交聯劑在整個過程中保持復合物穩定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩定的蛋白質-DNA相互作用則不需要交聯。接下來，使用裂解液透化細胞膜，釋放細胞組分，然后蛋白質-DNA復合物變得可溶。去除細胞溶質蛋白以減少背景信號并增加靈敏度。注意：此時可以停止ChIP測定。 經過交聯，淬滅和洗滌細胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲存。華南地區高效qPCR儀使用說明qPCR面對小的差異較弱，dPCR則可識別差異較小的拷貝數。

染色質片段化——DN段化:細胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 分辨率的關鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對之間。剪切是難控制的步驟之一。通過超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實現剪切，各有利弊。超聲處理需要大量的手動操作時間，但非常適合難以裂解的細胞；酶促消化不需要手動操作，適用于大量樣品的處理，但其剪切位點不是隨機的。兩種方法都需要根據具體細胞系進行優化。注意：此時可以停止ChIP。經過剪切/消化染色質后，可以將樣品于-80°C儲存。避免反復凍融。

免疫沉淀——捕獲并分離蛋白質-DNA復合物使用抗體捕獲蛋白質-DNA復合物中的目標蛋白質是實驗成功的關鍵因素。抗體免疫沉淀并從細胞核組分中分離蛋白質，去除不相關的細胞物質。使用抗體結合磁珠完成所得抗體-蛋白質-DNA復合物的純化。經過孵育后，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質-DNA復合物，純化并洗脫蛋白質-DNA復合物。制備DNA——解交聯和DNA純化:現在含有目標蛋白質的染色質片段已分離，需要解交聯并純化DNA。解交聯通常采用高熱孵育和/或消化來完成。注意：此時可以停止ChIP。經過解交聯和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲存。Taqman探針法因特異性高，被廣泛應用于等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重定量等。

常規PCR中，PCR產物通過凝膠電泳，然后進行成像分析，常規PCR只能通過終點法對擴增產物進行定性分析，而不能進行定量分析；熒光定量PCR中，PCR反應體系中加入了熒光分子，通過熒光信號的變化來反應擴增產物的變化，使PCR產物的實時檢測成為可能。相對常規PCR而言，熒光定量PCR的主要優點是準確地確定初始模版拷貝數和較高的檢測靈敏度；熒光定量PCR不僅可用于定性，如判斷一段序列的有無，也可用于定量，如確定起始模版的拷貝數；常規PCR的定量方法，測定的都是PCR的終產物，而不是起始DNA拷貝數。而從圖中可以看出，雖然相同模版在同一臺PCR儀上進行96次擴增，終點處檢測產物量不恒定，但96次PCR擴增曲線都有一個共同的拐點，即熒光定量PCR中Ct值的重現性，恒定的Ct值為熒光定量PCR的分析提供了理論依據。q225 加樣孔板側壁和金屬熱塊能夠嚴密貼合，使液體樣品迅速達到設定溫度，從而減少實驗時間。湛江qPCR儀消毒

qpcr在擴增每個循環中模板DNA通過變性、復性、延伸三個階段形成更多的子代DNA，為下一個循環提供模板DNA。湛江qPCR儀消毒

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現將其原理簡述如下：1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。2. SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBR與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。3.分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。PCR產物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產生熒光。湛江qPCR儀消毒

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