1983年，美國化學家Kary Mullis發明了聚合酶鏈反應技術(polymerase chain reaction， PCR)，這一技術將DNA聚合酶的特性結合核酸雙鏈的變性復性特性，采用適溫延伸、高溫變性以及低溫復性，讓目的核酸片段實現了特異性體外擴增，可將極微量的目標DNA特異地擴增上百萬倍，從而提高對DNA分子的分析和檢測靈敏度。尤其是耐熱DNA聚合酶的發現，更是極大地促進了PCR技術在分子生物學科研，及臨床分子診斷領域的廣泛應用。常用的 PCR 技術包括逆轉錄PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）和實時熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）等。經熒光定量PCR儀器檢測后，對核酸進行定性和定量分析。Quantagene q225mxqPCR儀型號

傳統定量PCR方法簡介：1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。珠三角熒光定量qPCR儀采購qPCR通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

原理：在DNA擴增反應中，通過熒光化學物質測定每次PCR循環后產物總量。目的：實現定量而不止是定性分析。通過與內參基因進行對比，對樣品中的特定基因進行相對表達量的計算，以實現定量分析。qPCR的檢測方法有兩種，SYBRGreenl法和TaqMan探針法，下面介紹常用的SYBRGreenl法。原理：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，使其特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。試劑及儀器：Hieff®QpcrSYBR®GreenMasterMix試劑(翌圣)和ABI7500Real-TimeSystem實時熒光定量PCR儀進行qRT-PCR擴增。

TwoSteprt-pcr和OneSteprt-pcr的選擇RealTimeRT-PCR反應可選擇TwoSteprt-pcr反應或OneStepRT-PCR反應,TwoStepRT-PCR反應是將反轉錄反應和RealTimePCR反應分兩步進行。進行TwoStepRT-PCR反應時,可選擇RandomPrimer、OligodtPrimer或基因的特異性引物進行反轉錄反應,然后再將一部分反轉錄反應液(cDNA)作為模板添加到RealTimePCR反應液中。使用反轉錄引物時可以根據實驗目的選擇合適的反轉錄引物,如果選擇RandomPrimer或OligodtPrimer,合成的cDNA可用于復數種類基因的檢測,cDNA溶液可以穩定地長期保存,供以后解析使用。OneSteprt-pcr的反轉錄反應和PCR反應在同一反應管內連續進行,操作簡單,污染幾率低。但此時的反轉錄反應和PCR反應都并非為各自的適條件,所以OneSteprt-pcr通常比TwoStepRT-PCR反應效率低。此外,與TwoStepPCR反應相比,反轉錄酶等的使用量多,每個反應的成本相對較高。OneSteprt-pcr反應的反轉錄反應引物只能使基因的特異性PCR下游引|物,而不能使用Randomprimer或OligodtPrimer共用引物。基因表達解析等絕大部分RT-PCR,適合選擇TwoSteprt-pcr反應,而RNA病毒檢測等以基因檢測為目的RT-CR反應,應優先考慮防止污染,所以比較好選擇OneSteprt-pcr反應。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。

TaqMan qPCR：該測定不使用嵌入染料，而是使用帶有 5' 熒光報告染料和 3' 淬滅染料的 TaqMan 探針。 這些探針是目標特異性的，并且在退火步驟中與引物之一下游的目標 DNA 序列結合。 當 Taq 聚合酶在延伸階段遇到 TaqMan 探針時，它會置換并切割 5' 報告染料。 一旦報告染料與淬滅染料分離，其在每個 qPCR 循環結束時的可測量熒光信號就會顯著增加。 第二條 DNA 鏈是平行合成的，但由于沒有探針附著在它上面，因此無法通過熒光測量來監測這一過程。與 SYBR Green 檢測相比，使用 TaqMan 探針的成本更高，但也具有兩個顯著優勢：TaqMan 檢測測量目標序列的擴增進程，因為探針是目標特異性的。您可以通過向主混合物中添加不同的引物和具有不同報告染料的 TaqMan 探針來監測單個反應中各種 qPCR 產物的數量。 這種多重方法允許您在每個熱循環結束時檢測多個熒光信號。Taqman探針法因特異性高，被廣泛應用于等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重定量等。華南地區酷博qPCR儀價格

TaqMan方法通過采用熒光探針在PCR循環過程中隨著特定PCR產物的累計而對其進行檢測。Quantagene q225mxqPCR儀型號

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