TaqMan 方法的優點：需要在探針和目標分子（靶點）之間發生特異性的水解（雜交），方可生成熒光信號。可使用明顯不同的報告基因染料標記探針，在一個反應管內擴增并檢測兩個不同的序列。無需PCR后處理，減少分析工作量并節省材料成本。TaqMan方法的缺點：TaqMan方法的主要缺點在于需要根據不同的序列，合成不同的探針。SYBR Green I染料試劑。一般將可與雙鏈DNA發生結合的小分子分為以下兩類：嵌入劑、小溝結合物。無論哪種結合方法，用于PCR實時檢測的DNA結合染料都需要滿足以下兩個條件：結合至雙鏈DNA時，會有增強的熒光對 PCR 不會產生抑制我們開發更加優化的條件，使得SYBR Green I染料的使用不會對PCR產生抑制并帶來相對于溴化乙錠更為靈敏的檢測。Quantagene q225系列qPCR 43分鐘完成實驗，加3分鐘做完熔解曲線只需43分鐘即可完成40循環的常規qpcr實驗。珠三角快速qPCR儀使用說明

陰性對照一般是指用水代替模板的反應孔，體系中除了模板，包括了其他的反應組分。由于qPCR的高靈敏性，陰性對照有出現擴增信號的情況，那么在針對這類問題時，我們需要判斷其原因所在。使用染料法進行qPCR實驗時，首先查看陰性對照的溶解曲線主峰是否跟陽性孔的主峰位置一致。如果一致，要看兩者Cq相差多少，比如，針對某一種引物的實驗樣品Cq值為28. 5，陰性對照的Cq值為33. 6，由于Cq值相差大于5，如果按95%的擴增效率計算，兩者模板量相差28倍之多，對分析數據影響不大，所以實驗樣品的Cq值還是可以采用的；但是，如果兩者的Cq值相差 1~2，這說明陰性對照中有較大的模板污染，則需要考慮更換試劑或引物，分區加樣，重新實驗。如果不一致，陰性對照主峰對應的Tm值小于陽性孔的Tm值，則可能是引物性能不好，無模板或使用低濃度模板下會出現引物二聚體，這種情況則需要考慮更換引物，保證引物特異性以及擴增效率。珠三角快速qPCR儀使用說明PCR 反應中通過控制溫度變化使得核酸分子重復地解鏈與延伸，從而實現對目的片段的指數擴增。

免疫沉淀——捕獲并分離蛋白質-DNA復合物使用抗體捕獲蛋白質-DNA復合物中的目標蛋白質是實驗成功的關鍵因素。抗體免疫沉淀并從細胞核組分中分離蛋白質，去除不相關的細胞物質。使用抗體結合磁珠完成所得抗體-蛋白質-DNA復合物的純化。經過孵育后，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質-DNA復合物，純化并洗脫蛋白質-DNA復合物。制備DNA——解交聯和DNA純化:現在含有目標蛋白質的染色質片段已分離，需要解交聯并純化DNA。解交聯通常采用高熱孵育和/或消化來完成。注意：此時可以停止ChIP。經過解交聯和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲存。

與標準 PCR 一樣，SYBR Green 方案由變性、退火和延伸階段組成。 不同之處在于，您在 qPCR 設置期間將一些雙鏈 DNA 結合染料 SYBR Green I 添加到預混液中。 這種熒光染料在延伸階段嵌入到雙鏈 DNA 序列中，顯示出熒光信號的強烈增加。 在每個熱循環結束時測量此信號將使您能夠確定存在的雙鏈 DNA 的數量。SYBR Green 檢測的缺點是染料會與任何雙鏈 DNA 序列結合。 這意味著您還可以檢測非特異性 qPCR 產物（例如引物二聚體）發出的熒光。 為消除這種風險，通過執行熔解曲線分析檢查反應特異性，或使用 TaqMan 方法。q225 出色的熱循環系統設計使得40 個循環的常規 qPCR 可以在短短43 分鐘內輕松完成，讓您的工作效率獲得質提升 。

內標在傳統定量中的作用：由于傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．內標對定量PCR的影響：若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為***。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。終點法檢測（也稱 “讀板檢測”）測量的是PCR循環結束時累計的PCR產物量。珠三角快速qPCR儀使用說明

qPCR只能實現相對定量，即必須使用標準品生成標準曲線，才能進行定量。珠三角快速qPCR儀使用說明

qPCR中的熒光探針是一種短鏈寡核苷酸，帶有熒光基團和淬滅基團，它可以特異結合目的產物的DNA序列。其檢測原理是熒光共振能量轉移（FRET），即熒光基團和淬滅基團在目標DNA分子擴增過程中因為聚合酶的外切活性從而水解分離使熒光信號的釋放；隨著擴增過程的推進，機器實時檢測增強的熒光信號，從而產生終的熒光擴增曲線。根據修飾基團標記和能量轉移方式，可以將探針分為TaqMan探針、分子信標和其他探針。TaqMan探針（熒光淬滅水解探針）現今常用的TaqMan探針主要是水解探針，其多是5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團的短單鏈寡聚核苷酸。在qPCR反應中，基于TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，對TaqMan探針進行切割，使熒光基團和猝滅基團分離，熒光基團發出的熒光信號不會被淬滅，釋放的熒光信號被機器接收。TaqMan探針的qPCR相比于染料法多了一條TaqMan探針，可以特異性結合DNA序列，因而具有更好的特異性，但探針合成價格偏高。珠三角快速qPCR儀使用說明

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