實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）通過在普通 PCR 反應體系中加入了熒光標記探針或熒光染料，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物變化。通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。具有專一性更高、可實時監控、可重復精確定量等優勢。qPCR的種類根據qPCR的化學發光原理一般分為2大類：一類是探針法，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加；一類是基于SYBR Green I 的染料法，通過熒光染料來指示產物的增加。SYBR Green I 是一種結合于所有雙鏈DNA（dsDNA）雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料。蘇州準確qPCR儀設置

qPCR中的熒光探針是一種短鏈寡核苷酸，帶有熒光基團和淬滅基團，它可以特異結合目的產物的DNA序列。其檢測原理是熒光共振能量轉移（FRET），即熒光基團和淬滅基團在目標DNA分子擴增過程中因為聚合酶的外切活性從而水解分離使熒光信號的釋放；隨著擴增過程的推進，機器實時檢測增強的熒光信號，從而產生終的熒光擴增曲線。根據修飾基團標記和能量轉移方式，可以將探針分為TaqMan探針、分子信標和其他探針。TaqMan探針（熒光淬滅水解探針）現今常用的TaqMan探針主要是水解探針，其多是5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團的短單鏈寡聚核苷酸。在qPCR反應中，基于TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，對TaqMan探針進行切割，使熒光基團和猝滅基團分離，熒光基團發出的熒光信號不會被淬滅，釋放的熒光信號被機器接收。TaqMan探針的qPCR相比于染料法多了一條TaqMan探針，可以特異性結合DNA序列，因而具有更好的特異性，但探針合成價格偏高。華南地區靈敏度qPCR儀設置qPCR通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準確，重現性比較好的定量方法，已得到全世界的公認，范圍廣用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

內標在傳統定量中的作用：由于傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．內標對定量PCR的影響：若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為***。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。由于qPCR的高靈敏性，陰性對照有出現擴增信號的情況，那么在針對這類問題時，我們需要判斷其原因所在。

TwoSteprt-pcr和OneSteprt-pcr的選擇RealTimeRT-PCR反應可選擇TwoSteprt-pcr反應或OneStepRT-PCR反應,TwoStepRT-PCR反應是將反轉錄反應和RealTimePCR反應分兩步進行。進行TwoStepRT-PCR反應時,可選擇RandomPrimer、OligodtPrimer或基因的特異性引物進行反轉錄反應,然后再將一部分反轉錄反應液(cDNA)作為模板添加到RealTimePCR反應液中。使用反轉錄引物時可以根據實驗目的選擇合適的反轉錄引物,如果選擇RandomPrimer或OligodtPrimer,合成的cDNA可用于復數種類基因的檢測,cDNA溶液可以穩定地長期保存,供以后解析使用。OneSteprt-pcr的反轉錄反應和PCR反應在同一反應管內連續進行,操作簡單,污染幾率低。但此時的反轉錄反應和PCR反應都并非為各自的適條件,所以OneSteprt-pcr通常比TwoStepRT-PCR反應效率低。此外,與TwoStepPCR反應相比,反轉錄酶等的使用量多,每個反應的成本相對較高。OneSteprt-pcr反應的反轉錄反應引物只能使基因的特異性PCR下游引|物,而不能使用Randomprimer或OligodtPrimer共用引物。基因表達解析等絕大部分RT-PCR,適合選擇TwoSteprt-pcr反應,而RNA病毒檢測等以基因檢測為目的RT-CR反應,應優先考慮防止污染,所以比較好選擇OneSteprt-pcr反應。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）指的是在PCR進行的同時，對其過程進行監測的能力。華南地區靈敏度qPCR儀設置

實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度。蘇州準確qPCR儀設置

qpcr的檢測原理：qPCR主要是使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)，利用實時積累的熒光信號監測整個擴增過程，然后通過標準曲線來對未知模板進行定量分析。qPCR 主要是依賴于標準品制備標準曲線，進而去確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。隨著PCR的循環進行，染料熒光強度增加，從而檢測到定量反應的DNA。SYBR Green是一種DNA插入染料，范圍廣用于qPCR。雖然SYBR Green方法比探針方法便宜，但是特異性沒有熒光探針方法好。蘇州準確qPCR儀設置

廣州雙螺旋科學儀器有限公司是以數字PCR，純水機，病理切片機，倍性分析儀研發、生產、銷售、服務為一體的儀器儀表批發;商品批發貿易（許可審批類商品除外）;商品零售貿易（許可審批類商品除外）;教學設備的研究開發;辦公設備耗材批發;生物技術開發服務;生物技術推廣服務;計算機批發;生物技術轉讓服務;農業科學研究和試驗發展;醫學研究和試驗發展;自然科學研究和試驗發展;水處理設備的研究、開發;食品科學技術研究服務;環保設備批發;辦公設備批發;企業，公司成立于2015-04-17，地址在廣州市黃埔區銳豐三街4號617房。至創始至今，公司已經頗有規模。公司主要產品有數字PCR，純水機，病理切片機，倍性分析儀等，公司工程技術人員、行政管理人員、產品制造及售后服務人員均有多年行業經驗。并與上下游企業保持密切的合作關系。臻準,美國艾科浦,銳訊生物,Sysmex,Eprerdia致力于開拓國內市場，與精細化學品行業內企業建立長期穩定的伙伴關系，公司以產品質量及良好的售后服務，獲得客戶及業內的一致好評。廣州雙螺旋科學儀器有限公司通過多年的深耕細作，企業已通過精細化學品質量體系認證，確保公司各類產品以高技術、高性能、高精密度服務于廣大客戶。歡迎各界朋友蒞臨參觀、 指導和業務洽談。