昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（IC-BEVS）是一種真核表達(dá)系統(tǒng)，以桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲細(xì)胞為宿主實(shí)現(xiàn)外源蛋白的生產(chǎn)。該系統(tǒng)具備便于規(guī)模化生產(chǎn)、培養(yǎng)成本低、生物安全性高等優(yōu)勢(shì)，近年已逐步應(yīng)用于重組蛋白、rAAV 載體、亞單位疫苗（如病毒樣顆粒（VLP）疫苗）等產(chǎn)品的生產(chǎn)，在生物制品重組蛋白表達(dá)領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。Sf9 細(xì)胞系源自草地夜蛾細(xì)胞系（Spodoptera frugiperda cell line，簡(jiǎn)稱 Sf），是當(dāng)前較為常用的昆蟲細(xì)胞系之一。SHENTEK^® Sf9 HCP 殘留蛋白檢測(cè)試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法），可對(duì)采用 Sf9 細(xì)胞系生產(chǎn)的生物制品中宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留進(jìn)行定量檢測(cè)。該試劑盒的抗體覆蓋率分別為 70.4%-96.0%（采用 IMBS-2D 法）和 91.2%（采用 IMBS-MS 法，Unique Peptide ≥2）。

LC-MS技術(shù)作為生物制品宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)的新趨勢(shì)，應(yīng)用時(shí)需重點(diǎn)考慮以下五方面：①穩(wěn)定性：需對(duì)HCPs的LC-MS檢測(cè)流程開展驗(yàn)證，全流程需實(shí)施嚴(yán)格QC管控，以保障檢測(cè)結(jié)果的一致性與穩(wěn)定性。②可重復(fù)性：不同類型生物制品中HCPs的提取效率存在差異，且不同人員操作會(huì)產(chǎn)生偏差，因此需在上機(jī)前通過多種方法評(píng)估HCPs提取效率，規(guī)避人為因素導(dǎo)致的結(jié)果重復(fù)性不佳問題。③準(zhǔn)確度：在方法開發(fā)與驗(yàn)證階段，需設(shè)置內(nèi)標(biāo)并確定定量算法，通過內(nèi)標(biāo)響應(yīng)回算得出HCPs含量，以此保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。④抗干擾能力：高豐度蛋白與特殊基質(zhì)會(huì)干擾質(zhì)譜檢測(cè)，需借助前處理手段去除高豐度蛋白或特殊基質(zhì)，從而降低其對(duì)HCPs肽段質(zhì)譜檢測(cè)的影響。⑤真實(shí)性：樣品中除HCPs外的其他物質(zhì)在質(zhì)譜分析中也會(huì)產(chǎn)生質(zhì)譜信號(hào)，需去除復(fù)雜背景噪音以避免假陽性與假陰性情況，同時(shí)建立規(guī)范的生信分析流程。在分析流程搭建過程中，同樣需制定嚴(yán)格的QC標(biāo)準(zhǔn)，并通過后續(xù)多種方法驗(yàn)證，明確該標(biāo)準(zhǔn)的真實(shí)性。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）多與細(xì)胞關(guān)鍵功能相關(guān)，例如細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成修飾、細(xì)胞存活及凋亡等，在生產(chǎn)工藝中會(huì)因細(xì)胞分泌、死亡或裂解而釋放。生產(chǎn)過程里，有三大因素主要影響 HCP 的組成與豐度：①宿主細(xì)胞基因組調(diào)控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下，潛在 HCP 數(shù)量可能極多，且并非所有基因都會(huì)表達(dá)，部分基因的表達(dá)具有時(shí)間和條件特異性；像大腸桿菌約含 4300 個(gè)基因，不同工藝產(chǎn)物會(huì)經(jīng)歷獨(dú)特的翻譯后修飾，這增加了 HCP 的總數(shù)與生化復(fù)雜性。研究顯示，大腸桿菌表達(dá)的蛋白間存在數(shù)量差異，這種差異可能是對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性反應(yīng)，但 85-90% 具有潛在免疫原性的 HCP 在不同發(fā)酵過程中均會(huì)出現(xiàn)。②產(chǎn)物表達(dá)方式：宿主細(xì)胞與外源基因、載體及輔助成分構(gòu)成的體系，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、瞬時(shí)及誘導(dǎo)表達(dá)；以大腸桿菌為例，常見表達(dá)形式包括胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)、可溶性表達(dá)、不溶性包涵體形式，還有融合與非融合表達(dá)。③純化步驟及產(chǎn)品自身特性的影響：純化過程中能去除 99% 以上的 HCP，但仍有少量殘留 HCP 留在產(chǎn)品中，這些殘留 HCP 可能與產(chǎn)品結(jié)合，隨產(chǎn)品一同被純化。

美國藥典（USP）1132 章節(jié)中，推薦的 HCP 抗體純化方式有兩種，分別是 Protein A/Protein G 親和柱層析法與 HCP 抗原親和柱層析法。這兩種方法各有特點(diǎn)與不足，且均滿足監(jiān)管層面的要求。在實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景中，針對(duì)不同產(chǎn)品，兩種方法可能造成檢測(cè)結(jié)果的差異。兩種方法所獲抗體的關(guān)鍵差異，在于 HCP 抗體有效含量的占比不同。其中，HCP 抗原親和柱層析法的有效含量占比明顯更高，但該方法存在部分 HCP 抗體流失的情況，這會(huì)使得針對(duì)特定樣本的檢測(cè)結(jié)果低于前者，因此企業(yè)在實(shí)際建立檢測(cè)方法時(shí)，需開展充分評(píng)估。此外，HCP 抗原親和柱層析法對(duì)純化工藝的要求更為嚴(yán)格，若要確?？贵w的批間一致性，需重點(diǎn)考察 HCP 抗原柱的制備工藝、柱子的使用壽命以及再次制備時(shí)的一致性等關(guān)鍵問題。

宿主細(xì)胞蛋白（HCPs）是生物制品生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的重要工藝相關(guān)雜質(zhì)，不僅可能引發(fā)患者不良免疫反應(yīng)、超敏反應(yīng)，還可能造成產(chǎn)品蛋白降解等問題，進(jìn)而影響生物制品的安全性與有效性，因此成為生物制品質(zhì)量控制中的關(guān)鍵指標(biāo)。目前 HCPs 殘留檢測(cè)的常用方法為 ELISA 法，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高且檢測(cè)通量較高，是 HCPs 殘留的日常放行檢測(cè)方法，各國藥典均對(duì)采用酶聯(lián)免疫法開展 HCPs 殘留檢測(cè)作出規(guī)定。不過，采用 ELISA 法檢測(cè) HCPs 殘留仍存在不少挑戰(zhàn)：在實(shí)際生產(chǎn)工藝中，宿主細(xì)胞來源、生產(chǎn)工藝路線、純化技術(shù)、生產(chǎn)規(guī)模等因素，均可能改變 HCPs 的種類與復(fù)雜程度，給檢測(cè)帶來不確定性。

美國藥典 <1132> 與歐洲藥典 < 2.6.34 > 建議，對(duì)即將進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)（臨床 III 期及后續(xù)階段）或生產(chǎn)工藝已穩(wěn)定的生物制品，采用定制化 ELISA 試劑盒開展宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)，背后原因主要包括四點(diǎn)：①確保檢測(cè)方法能充分覆蓋實(shí)際工藝產(chǎn)生的 HCPs，防止漏檢關(guān)鍵雜質(zhì)；②為更準(zhǔn)確的免疫原性與安全性評(píng)估提供支持；③提供真實(shí)的工藝表征數(shù)據(jù)，而非推測(cè)性數(shù)據(jù)；④滿足商業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量控制對(duì)方法一致性的要求。此外，研究人員對(duì)當(dāng)前市場(chǎng)常見的 HCP ELISA 商業(yè)化試劑盒進(jìn)行測(cè)試，并將其與 HCP ELISA 定制化試劑盒對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同商業(yè)化試劑盒檢測(cè)同一樣品的數(shù)值差異明顯，且準(zhǔn)確性均低于定制化試劑盒 —— 這一結(jié)果表明，定制化試劑盒更能滿足產(chǎn)品質(zhì)量控制的實(shí)際需求。