北京重組蛋白熱原檢測結果判定

來源：發布時間：2025-12-01

MAT法熱原檢測中，獲得標準 S 型標曲需通過顯色時機控制與圖形調整實現，確保標曲擬合準確。在顯色時機控制上，加入 TMB 底物后，孔內顏色會逐漸變藍，且隨反應時間加深，當標準品濃度梯度呈現明顯藍色差異（如高濃度孔深藍色、低濃度孔淺藍色）時，即可加入終止液；若儀器含 600nm 波長，可在終止前檢測高濃度標準品的 OD600nm 值，當達到 1.0 左右時終止，此時顯色反應處于線性期，終止后顏色由藍變黃，信號強度約增強 3 倍，易形成 S 型曲線。在圖形調整上，若標曲擬合后未呈現明顯 S 型，可通過調整坐標軸范圍優化—如將縱軸（OD 值）范圍設為 0-2.5，橫軸（熱原濃度）設為對數坐標，突出低濃度區的拐點與高濃度區的平臺區，使曲線更接近 S 型。此外，標曲配制需確保濃度點單獨配制（非連續稀釋），避免高濃度標準品污染低濃度點，導致低濃度區信號異常升高，破壞 S 型曲線形態。通過以上方法，可有效提升 S 型標曲的成功率，保障熱原定量的準確性。

MAT 熱原檢測能幫助分析和解決生物制品生產中出現的低內毒素回收（LER）現象。北京重組蛋白熱原檢測結果判定

MAT 法熱原檢測中，細胞傳代的代次控制是保障檢測穩定性的關鍵，需結合細胞特性與文獻數據制定標準。參考行業文獻，單核細胞系（如 HL-60、THP1）的使用代次通常不超過 20 代，代次過高會導致細胞生物學特性改變：一是 TLR 受體表達下降，如 TLR4 表達量在 20 代后下降 40%，導致內毒素檢測靈敏度降低；二是細胞倍增時間延長，從 24 小時延長至 36 小時，影響共培養時長的準確性；三是炎癥因子分泌減少，IL-6 分泌量在 20 代后下降 35%，導致熱原濃度低估。申科對配套的 HL-60 細胞系進行代次穩定性驗證，結果顯示：1-15 代細胞的熱原響應性一致（加標回收率 85%-125%），16-20 代回收率波動至 70%-130%，21 代后回收率 < 70%，因此建議控制在 1-15 代使用。實驗室需建立細胞代次記錄制度，每傳代 1 次記錄代次，達到 15 代后及時更換新批次細胞，并驗證新批次細胞與舊批次的一致性（如檢測同一樣品，結果偏差≤20%），確保不同代次細胞的檢測結果穩定。

上海血液制品熱原檢測歐盟出口方案生物制品的高蛋白、螯合劑基質易對鱟試驗產生抑制，rCR與MAT聯合策略可消除干擾并控制熱原。

PyroSHENTEK^®熱原檢測試劑盒（貨號 1502100，規格 96 測試 / 盒）優勢在于搭載 MAT 特定單核細胞系，細胞表面表達多種 Toll 樣受體（TLR），可響應不同類型熱原。該細胞系來源清晰、可溯源，均一性強且無供體依賴，有效規避了傳統 PBMC 因供體差異導致的結果波動，同時安全風險低，無需擔憂外源因子污染。試劑盒采用 “標準化單核細胞 + ELISA 檢測” 一體化體系，通過嚴格的細胞質量控制（如凍存復融后活率達標），確保每次檢測的細胞狀態一致；搭配預包被 IL-6 抗體的酶標板與配套試劑，進一步減少體系誤差。從標曲數據來看，其擬合采用 4-Parameter Logistic 模型，R2 達 1.000，EC50 為 0.119EU/mL，參數置信區間穩定，復孔結果重復性優異，能為熱原定量提供準確如一的數據支撐，避免因體系不穩定導致的檢測偏差。

含消除炎癥成分的樣品可能抑制 IL-6 產生，需通過科學評估排除干擾，確保 MAT 法熱原檢測結果準確。根據藥典要求，若樣品能抑制單核細胞促炎癥因子釋放，需通過以下步驟驗證適用性：首先，選擇樣品 A、2A、4A 倍稀釋（均不超過上限有效稀釋倍數 MVD），避免高濃度消除炎癥成分過度抑制；其次，進行供試品加標回收率實驗，若回收率在 50%-200% 的合格范圍，說明消除炎癥成分未影響熱原檢測；再對比 “供試品配制的標曲” 與 “稀釋液配制的標曲”，若兩者 IL-6 檢測值相差在 ±20% 以內，表明樣品基質對檢測無系統性干擾。例如，某消除炎癥單抗樣品經 2 倍稀釋后，加標回收率達 120%，兩種標曲 IL-6 值相差 15%，判定可適用 MAT 法。若出現回收率偏低（<50%），可嘗試增加稀釋倍數（如 8A 倍）或采用熱滅活（若樣品耐熱）去除消除炎癥活性；若仍無法排除干擾，需結合家兔法進行對比驗證，避免因消除炎癥成分導致假陰性。

2023年PRIMM研究：聚山梨酯80 mRNA疫苗中，家兔法熱原檢查因LER漏檢41%，MAT回收率98%+。

湖州申科生物熱原檢測試劑盒（MAT 法，貨號 1502100）包含完整的檢測體系，組分按功能可分為細胞培養類、ELISA 檢測類與輔助類，且儲存條件明確。細胞培養類組分包括：2-8℃儲存的培養液（25mL×2 瓶）、96 孔細胞孵育板，-18℃儲存的培養液添加劑（1.5mL×1 管）、細菌內毒素工作標準品，以及需液氮保存的 MAT 細胞（2 支），確保細胞活性與穩定性。ELISA 檢測類組分涵蓋：2-8℃儲存的生物素偶聯抗 IL-6 抗體（200×，60μL）、鏈霉親和素 HRP 復合物（100×，140μL）、TMB 顯色液（12mL）、終止液（6mL），以及抗 IL-6 預包被酶標板（8 孔 ×12 條），無需額外制備抗體，即開即用。輔助類組分包括細菌內毒素檢查用水（8mL×1 管）、稀釋液（25mL）、濃縮緩沖液（10×，25mL×2 瓶）與封板膜，滿足從樣品稀釋到檢測終止的全流程需求。各組分儲存條件嚴格區分，避免因儲存不當導致性能下降，保障檢測結果可靠。

熱原檢測歷經動物整體試驗、體外生化反應到細胞免疫應答的三階段演進，靈敏度與效率不斷提升。江蘇原料藥熱原檢測家兔法替代方案

中國藥典規定 MAT 法標曲需 4 個平行孔、濃度點≥4，推薦四參數擬合，r≥0.90。北京重組蛋白熱原檢測結果判定

MAT 試劑盒配套的即用型細胞存在明確的傳代限制，且商業化傳代需獲得授權，關鍵是保障細胞質量與檢測可靠性。首先，即用型細胞經特殊工藝優化，已處于較好的活性與熱原響應狀態，不適合傳代，傳代后細胞會出現 TLR 受體表達下降、炎癥因子分泌減少等問題，導致熱原檢測靈敏度降低，如 HL-60 細胞傳代超過 5 代后，IL-6 分泌量下降 30%，無法滿足檢測要求。其次，若用戶需將即用型細胞用于商業化生產（如大規模檢測），需獲得湖州申科授權，包括用戶資質審核、技術培訓、傳代方案驗證，確保用戶具備細胞培養與質量控制能力，避免未經授權傳代導致細胞特性改變，影響檢測結果一致性。此外，參考文獻數據，即使是可傳代的單核細胞系，使用代次也不超過 20 代，超過后代次細胞穩定性差，因此即用型細胞設計為 “一次性使用”，從源頭避免傳代帶來的風險。用戶需嚴格遵守傳代限制，若需長期使用，建議定期采購新批次試劑盒，確保細胞質量。

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標簽：宿主細胞殘留DNA檢測支原體檢測宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測熱原檢測內毒素檢測

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