各國法規(guī)要求對生物藥品開展分析與純化處理，以將宿主細(xì)胞蛋白（HCP）降至可接受水平；即便終產(chǎn)品中痕量 HCP 進(jìn)入患者體內(nèi)，目前仍不明確特定殘留蛋白質(zhì)雜質(zhì)是否會(huì)對藥物的穩(wěn)定性或免疫原性產(chǎn)生影響。在 HCP 限量標(biāo)準(zhǔn)方面，美國藥典推薦終產(chǎn)品 HCP 水平為 1-100 ng/mg；中國藥典各論則明確，大腸桿菌（E.coli）菌體 HCP 需不高于蛋白質(zhì)總量的 0.10%（即 1000 ng/mg），CHO 細(xì)胞 HCP 需不高于蛋白質(zhì)總量的 0.05%（即 500 ng/mg），假單胞菌 HCP 需不高于蛋白質(zhì)總量的 0.02%（即 200 ng/mg）。

操作規(guī)范是影響宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。一方面，實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)能力與實(shí)操經(jīng)驗(yàn)會(huì)影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，熟練人員可準(zhǔn)確完成樣品處理、試劑配制及儀器操作，降低人為誤差。另一方面，科學(xué)的HCP檢測方法在開發(fā)與應(yīng)用階段，需納入操作的合理變動(dòng)區(qū)間（即耐用性）并配套質(zhì)控措施，從流程層面較大程度規(guī)避人為誤差對結(jié)果的干擾。此外，嚴(yán)格遵照標(biāo)準(zhǔn)操作流程（SOP）是保障檢測結(jié)果可靠性的關(guān)鍵，操作步驟不規(guī)范易造成結(jié)果重復(fù)性不佳或誤差擴(kuò)大。目前，湖州申科已正式推出全自動(dòng)HCP ELISA檢測系統(tǒng)，可完成樣品制備、孵育、洗板到數(shù)據(jù)采集的全流程操作，搭配實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIMS），能實(shí)現(xiàn)“輸入即輸出”，降低流程誤差。

宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測抗體覆蓋率評(píng)估實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，需要在建立實(shí)驗(yàn)方法階段對關(guān)鍵步驟進(jìn)行充分的驗(yàn)證，以證明實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)健性。湖州申科開發(fā)的基于磁珠捕獲的IMBS方法（immunomagnetic beads separation），在開發(fā)過程中對關(guān)鍵步驟進(jìn)行了充分驗(yàn)證,相關(guān)結(jié)果經(jīng)過專業(yè)評(píng)審，驗(yàn)證的內(nèi)容如下（部分）：①方法優(yōu)化：針對磁珠與抗體的偶聯(lián)比例、洗滌液體積、洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化驗(yàn)證，以保證方法的穩(wěn)健性；②過程質(zhì)控：二維電泳存在實(shí)驗(yàn)步驟多，時(shí)間跨度長，中間步驟難以控制等缺陷，因此在等電聚焦實(shí)驗(yàn)部分設(shè)計(jì)了熒光標(biāo)記多肽，可快速判斷等電聚焦效果。在SDS-PAGE電泳的兩側(cè)增加40 ng銀染質(zhì)控，用于銀染顯色的控制；③方法重復(fù)性：針對2D分析以及LC-MS分析進(jìn)行重復(fù)性確認(rèn)，其中2D分析方法重復(fù)性可達(dá)到80%以上，LC-MS分析方法可到90%以上；④上樣量優(yōu)化：針對2D分析以及LC-MS分析進(jìn)行上樣量確認(rèn)，消除上樣量差異對檢測結(jié)果帶來的影響；⑤假陽性：排除樣品與陰性抗體之間是否存在非特異性結(jié)合，確定IMBS實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的步驟、參數(shù)是否有假陽性結(jié)果存在。

湖州申科生物依據(jù)不同宿主的實(shí)際生產(chǎn)工藝，借助高質(zhì)量免疫原與HCP多抗的標(biāo)準(zhǔn)化制備流程，制備出高效價(jià)、高覆蓋率的抗體，進(jìn)而開發(fā)出SHENTEK^®HCP檢測試劑盒：適配大腸桿菌表達(dá)菌（BL21）生產(chǎn)工藝及克隆菌堿裂法提取質(zhì)粒工藝，以及適配CHO、MDCK、HEK293、Sf9、VERO、畢赤酵母等不同宿主，可用于中間品、原液及終產(chǎn)品的HCP定量監(jiān)測。為保障ELISA法對HCP定量檢測的準(zhǔn)確性，需對HCP抗體覆蓋率開展驗(yàn)證。湖州申科的抗體覆蓋率平臺(tái)，采用2D Clean-up試劑盒去除蛋白樣品中的干擾物（如洗滌劑、鹽、脂質(zhì)、酚類、核酸等離子污染物），同時(shí)設(shè)置2D質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)施嚴(yán)格質(zhì)控，并以陰性抗體作為對照開展平行試驗(yàn)，以此提升結(jié)果準(zhǔn)確度。

湖州申科生物參考USP通則<1132.1>闡述的內(nèi)容，依托公司深耕生物制品質(zhì)量控制領(lǐng)域十余年經(jīng)驗(yàn)，針對LC-MS檢測HCPs方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)與優(yōu)化。同時(shí)通過對LC-MS檢測HCPs整體流程建立完整的質(zhì)控，建立起一套抗干擾能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高、結(jié)果真實(shí)可靠的LC-MS檢測HCPs標(biāo)準(zhǔn)方法。檢測技術(shù)平臺(tái)分成樣品制備、質(zhì)譜檢測、數(shù)據(jù)生信分析及質(zhì)譜結(jié)果方法驗(yàn)證四部分，已使用LC-MS平臺(tái)進(jìn)行了293T、不同工藝E.coli、CHO、Vero、MDCK、Sf9等不同工程細(xì)胞HCPs抗體覆蓋率的檢測分析。

由于 HCPs 屬于復(fù)雜的多分析物，為制備覆蓋率盡可能高的抗體（以覆蓋工藝特有的高風(fēng)險(xiǎn) HCPs），需采用可靠的免疫策略。獲得符合性能要求的抗體后，需借助經(jīng)過驗(yàn)證的 2D 或 LC-MS 方法對抗體覆蓋率進(jìn)行表征，確保抗體可充分覆蓋各實(shí)際工藝下產(chǎn)生的 HCPs。在擁有代表性抗原與優(yōu)良性能抗體的基礎(chǔ)上，開展 ELISA 檢測體系開發(fā)，涵蓋原輔料篩選與制備研究、各組分工藝及反應(yīng)體系研究、穩(wěn)定性研究等重要內(nèi)容。檢測體系開發(fā)完成后，需依據(jù) ICH 及藥典要求開展分析方法驗(yàn)證評(píng)估，確保體系的線性、范圍、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性及耐用性均滿足法規(guī)要求。