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來源: 發(fā)布時(shí)間:2020-05-02

分離純化某種蛋白質(zhì),首先要把蛋白質(zhì)從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來并保持原來的天然狀態(tài),不丟失生物活性。為此,動(dòng)物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織,種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮以免受單寧等物質(zhì)的污染,油料種子比較好先用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑等脫脂。然后根據(jù)不同的情況,選擇適當(dāng)?shù)姆椒ǎ瑢⒔M織和細(xì)胞破碎。動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿機(jī)破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁,一般需要用石英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ɑ蛴美w維素酶處理也能達(dá)到目的。細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較麻煩,因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實(shí)際上是一個(gè)借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子,非常堅(jiān)韌。破碎細(xì)菌細(xì)胞壁的常用方法有超聲波破碎,與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細(xì)胞破碎后,選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把所要的蛋白提取出來。細(xì)胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。天津蛋白純化填料哪家好

離子層析法 當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí),帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH等辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。 有機(jī)溶劑提取 蛋白質(zhì)純化有機(jī)溶劑提取的原理是:與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度明顯降低;而且在一定溫度、pH值和離子強(qiáng)度下,引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同,因此,控制有機(jī)溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì)。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰**白析出,從而純化冰**白。由于在室溫下,有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)的沉淀,而且伴隨著變性。質(zhì)量蛋白純化填料銷售廠家

如果所要的蛋白主要集中在某一細(xì)胞組分,如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性細(xì)胞質(zhì)等,則可利用差速離心的方法將它們分開,收集該細(xì)胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的,則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚,然后用適當(dāng)介質(zhì)提取。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液(有時(shí)還雜有核酸、多糖之類)獲得后,選用一套適當(dāng)?shù)姆椒ǎ瑢⑺牡鞍着c其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分離用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大,既能除去大量雜質(zhì),又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大,又不適于用沉淀或鹽析法濃縮,則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法進(jìn)行濃縮。

蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細(xì)純化階段二個(gè)階段。一般蛋白純化采用的方法為樹脂法。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細(xì)胞成分如DNA、RNA等分開,由于此時(shí)樣本體積大、成分雜,要求所用的樹脂高容量、高流速、顆粒大、粒徑分布寬.并可以迅速將蛋白與污染物分開,必要時(shí)可加入相應(yīng)的保護(hù)劑(例如蛋白酶抑制劑),防止目的蛋白被降解。精細(xì)純化階段則需要更高的分辨率,此階段是要把目的蛋白與那些分子量大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區(qū)分開來,要用更小的樹脂顆粒以提高分辨率,常用離子交換柱和疏水柱,應(yīng)用時(shí)要綜合考慮樹脂的選擇性和柱效兩個(gè)因素。選擇性指樹脂與目的蛋白結(jié)合的特異性,柱效則是指各蛋白成分逐個(gè)從樹脂上集中洗脫的能力,洗脫峰越窄,柱效越好。*有好的選擇性,洗脫峰太寬,蛋白照樣不能有效分離。

細(xì)分離 樣品經(jīng)粗分級(jí)分離以后,一般體積較小,雜蛋白大部分已被除去。進(jìn)一步純化,一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可選擇電泳法,包括區(qū)帶電泳、等電點(diǎn)聚焦等作為***的純化步驟。用于細(xì)分級(jí)分離的方法一般規(guī)模較小,但分辨率很高。 結(jié)晶是蛋白質(zhì)分離純化的***步驟。盡管結(jié)晶過程并不能保證蛋白一定是均一的,但是只有某種蛋白在溶液中數(shù)量上占有優(yōu)勢時(shí)才能形成結(jié)晶。結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的純化,而重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白。由于結(jié)晶過程中從未發(fā)現(xiàn)過變性蛋白,因此蛋白的結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)標(biāo)志,也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。廣州蛋白純化填料銷售廠家

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