所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法?！eal-timePCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。qPCR在原有PCR基礎上與熒光檢測方法結合，實現了PCR從定性到定量的飛躍，具有靈敏度高、特異性強的優點。佛山Quantagene q225qPCR儀采購

定量首先需要建立Ct值和拷貝數之間的線性關系，即標準曲線，標曲需要由標準品生成，標準品中基因序列要與待測樣品中基因序列一致，從而保證引物在兩者中擴增效率完全相同，標準品來源可以是質粒，純化的PCR產物或者基因組DNA等。標準品在加樣時需要注意體積比較好大于2微升，以減少標曲誤差，標曲是由不同梯度標準品生成，每個標準品梯度建立Ct值與拷貝數對數值之間的聯系，落在標曲上的梯度點比較好有5個及以上，至少3個點。標準品和待測樣品同時反應，將待測樣品檢測的Ct值代入標曲后即可換算出待測樣品中基因的拷貝數。深圳Quantagene q225qPCR儀消毒q225 加樣孔板側壁和金屬熱塊能夠嚴密貼合，使液體樣品迅速達到設定溫度，從而減少實驗時間。

傳統定量PCR方法簡介：1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現將其原理簡述如下：1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。2. SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBR與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。3.分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。PCR產物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產生熒光。實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度。

檢測原理：將一個樣本分成幾十到幾萬份，再將其分配到不同的反應單元中，使每個微滴單元包含一個或多個拷貝的核酸分子（即DNA模板），每個單元都會對目標分子進行擴增，檢測PCR擴增產物的熒光信號強度，帶入泊松分布即可計算出起始模板DNA濃度。dPCR原理:微滴式數字PCR檢測流程：其方法與qPCR類似，分為以下幾步。:1、DNA提取2、DNA濃度檢測并稀釋。3、配置PCR反應液。4、上機到PCR儀中進行檢測。5、PCR擴增。6、結果判讀。使用微滴數字PCR儀逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，終根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，計算出DNA濃度。

dPCR可用于常規qPCR所需的標準品定量，具有計量學意義 。廣東qPCR儀

由于qPCR的高靈敏性，陰性對照有出現擴增信號的情況，那么在針對這類問題時，我們需要判斷其原因所在。佛山Quantagene q225qPCR儀采購

所有儀器的操作都基本一致。設置的時候包括反應板設置（plate setup）和程序設置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細看一下反應設置：A. 首先是實驗目的選擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進行“定量”實驗。B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進行。C. 目的基因的設置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。D. 樣品的設置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設置和生物重復的設置。E. 對照組和內參基因的設置：這個是為后面的定量做準備F. 反應程序的設置：PCR反應程序的設置要根據不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環反應是95℃15秒，60℃15秒的40個循環。溶解曲線程序采用儀器默認設置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。G. 反應體系的設置：A-G這五個步驟簡單設置好，可以保存，修改反應程序或者立刻進行反應。

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