qPCR技術的本質是PCR技術，在擴增的每個循環中模板DNA通過變性、復性、延伸三個階段形成更多數量的子代DNA，為下一個循環提供模板DNA。在每個循環結束后，儀器會激發熒光物質并檢測一次熒光信號，那么每一個循環都會對應一個熒光信號值，將所有熒光信號值用光滑的曲線進行連接起來，便是 qPCR擴增曲線。如圖所示，根據qPCR擴增曲線整體趨勢，整個擴增過程主要分為四個時期，分別是基線期、指數增長期、線性增長期和平臺期。在基線期和平臺期，熒光信號均維持水平狀態，均不適用于對初始模板進行定量分析。在線性增長期，雖然擴增反應仍在進行，但隨著反應產物的積累，PCR反應受到明顯抑制導致擴增效率不斷降低，此時產物不再以指數形式增長，同樣不適用于定量分析初始模板量。根據qPCR擴增曲線整體趨勢，整個擴增過程主要分為四個時期，基線期、指數增長期、線性增長期和平臺期。佛山qPCR儀設置

交聯和裂解——穩定復合物并分離核組分:第一步對時間要求嚴格并且需要優化。體內共價交聯穩定蛋白質-DNA相互作用并于特定時間點進行分析。通常采用甲醛交聯，加入甘氨酸以終止反應。交聯劑滲透到完整細胞中并將蛋白質-DNA復合物鎖定在一起從而進行分析。交聯劑在整個過程中保持復合物穩定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩定的蛋白質-DNA相互作用則不需要交聯。接下來，使用裂解液透化細胞膜，釋放細胞組分，然后蛋白質-DNA復合物變得可溶。去除細胞溶質蛋白以減少背景信號并增加靈敏度。注意：此時可以停止ChIP測定。 經過交聯，淬滅和洗滌細胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲存。Quantagene q225mxqPCR儀采購qPCR通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

qPCR和dPCR:研究人員已經通過兩種方式克服了定量PCR分析的挑戰：實時定量PCR(qPCR)和數字PCR(dPCR)。qPCR主要使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)。通過監測PCR期間的熒光強度，可以比較多個樣品的DNA水平。數字PCR(dPCR)的基本工作原理很簡單。先將樣品分為多個PCR反應，每個反應多包含一個模板。然后通過對陽性和陰性反應進行計數來確定初始樣品中模板分子的數量。盡管qPCR和dPCR都能夠定量樣品中的核酸，但它們有一個重要的區別。qPCR只能實現相對定量(例如，樣品A的目標序列是樣品B的目標序列的兩倍)，除非使用此標準生成標準曲線。數字PCR本身是定量的，不需要標準曲線。另一方面，qPCR技術更加成熟和眾所周知，市場上有大量商業產品可供選擇。dPCR仍然是小的新鮮肉。它不如qPCR使用且價格昂貴。與dPCR相比，qPCR更適合于高通量分析，并且動態范圍廣。

染色質片段化——DN段化:細胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 分辨率的關鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對之間。剪切是難控制的步驟之一。通過超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實現剪切，各有利弊。超聲處理需要大量的手動操作時間，但非常適合難以裂解的細胞；酶促消化不需要手動操作，適用于大量樣品的處理，但其剪切位點不是隨機的。兩種方法都需要根據具體細胞系進行優化。注意：此時可以停止ChIP。經過剪切/消化染色質后，可以將樣品于-80°C儲存。避免反復凍融。在進行大量SNP標記分型時無需合成熒光探針和熒光引物。可以的節省實驗成本。

傳統定量PCR方法簡介：1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。熒光檢測系統可接收熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號累積和PCR產物形成是同步。華南地區快速qPCR儀設置

TaqMan方法通過采用熒光探針在PCR循環過程中隨著特定PCR產物的累計而對其進行檢測。佛山qPCR儀設置

在擴增曲線上，指定某個熒光強度值時可對應得到達到這個值所需的循環數。選擇合適的熒光強度值，該值的水平線可以切割到所有處于指數增長期的擴增曲線，這樣的熒光強度值稱為熒光閾值（threshold）。在熒光進入指數期初階段的熒光強度值符合這一特點。一般PCR擴增的初始循環（默認3~15個循環），熒光信號變化不大，接近直線，稱為基線（baseline），所以通常儀器默認的閾值是PCR反應~15個循環（熒光本底信號）的熒光信號標準偏差的10倍。當然，實際還需要結合PCR擴增效率、線性回歸系數等綜合考慮。也可以將閾值手動設置為大于熒光背景值和陰性對照（NTC）的熒光比較高值之間（進入指數期的初階段）。佛山qPCR儀設置

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