Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統主要特點：精確定量 以可靠的數據助力您的研究。采用擬合算法計算 Ct 值，定量誤差不超過±10%。液體冷卻循環系統確保孔間溫度高度一致，溫差不超過 ±0.15°C。光學系統無運動部件，穩定性增加，長期使用無需校準與維護。的儀器間重復性，不同位置、不同反應體積均不影響定量結果?？焖俑咝?用更短的時間獲得更多數據。40 個循環的常規 qPCR 只需43 分鐘，較常見qPCR 儀多縮短60% 的時間。在提高速度的同時保持了96 孔的高通量，滿足絕大多數實驗需求。小巧輕便 節省空間及您的寶貴樣品小體積為移動實驗和大量部署提供可能。5-10 μl 的推薦反應體積，較常規實驗節省80%的試劑用量，更節約您的珍貴樣品。定量檢測是一種實時的PCR (qPCR) 檢測。測量（定量）每輪PCR擴增循環中，檢測目標核酸片段的量。準確qPCR儀采購

1996年，美國ABI公司（現已并入ThermoFisher公司）推出首臺熒光定量PCR檢測系統，通過熒光定量PCR儀器實時接收擴增過程中熒光染料（或基團）釋放的信號，對反應進行實時監控，進而產生相應的擴增曲線。在qPCR反應中，每個循環結束熒光染料（或基團）都會釋放相應的熒光信號，這些信號與qPCR產物量成正比。qPCR擴增的階段，分為擴增早期、指數期和平臺期。在擴增早期，產物量很少，機器接收的熒光信號微弱可能會被覆蓋；產物量逐漸增多反應進入qPCR指數擴增期，這個階段可以通過指數期的某個點來對產物進行定量和計算起始的模板量；在擴增平臺期，產物達到一定量，同時熒光信號趨于穩定。在qPCR反應中，可以通過不同循環閾值（Cycle threshold，Ct）區分擴增信號和背景信號，通過調節閾值實現定性和定量分析。靈敏度qPCR儀材質實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度。

利用SYBR Green I可以檢測PCR反應中獲得的全部雙鏈DNA,但是不能區分不同的雙鏈DNA。為了進一步確保熒光檢測的就是靶DNA序列，人們又設計了能與目的DNA序列特異結合的熒光探針，如TaqMan探針。TaqMan探針是一小段被設計成可以與靶DNA序列中間部位結合的單鏈DNA（一般為50-150 bp）,并且該單鏈DNA的5'和3'端帶有短波長和長波長兩個不同熒光基團。這兩個熒光基團由于距離過近，在熒光共振能量轉移（FRET）作用下發生熒光淬滅，因而檢測不到熒光。PCR反應開始后，隨著雙鏈DNA變性產生單鏈DNA，TaqMan探針結合到與之配對的靶DNA序列上，并被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐個切除而降解，從而解除熒光淬滅的束縛，熒光基團在激發光下發岀熒光，所產生的熒光強度直接反映了被擴增的靶DNA總量。

qPCR擴增效率100%的理想條件下的PCR反應，PCR產物量呈指數倍增長Yn=Y0×2^n（X0：初始模板量，n：PCR循環次數，Yn：第n次循環后的產物量）而實際PCR擴增時可能存在模板質量不佳引起的PCR擴增抑制，DNA聚合酶的種類及活性影響，非特異性擴增產物的競爭等情況，擴增效率無法達到100%。擴增初期，PCR產物指數倍增加，隨著PCR產物的累積，各種影響因素的疊加，PCR產物不再指數倍增加，每個循環后產物增加量恒定，進入線性增長期，dNTP消耗殆盡，酶逐漸失活，擴增“停滯”，產物量恒定，進入平臺期。非理想條件下的PCR反應：PCR產物量Yn=Y0(1+Ex)^n（Ex：擴增效率）。dPCR可用于常規qPCR所需的標準品定量，具有計量學意義 。

PCR反應需要五種關鍵試劑：PCR模板：也稱為模板DNA，需要常規的試劑盒進行提取。如基因組DNA（gDNA），cDNA和質粒DNA。DNA聚合酶：所有PCR反應都需要可在高溫下工作的DNA聚合酶。Taq聚合酶是一種常用的酶，它可以在70°C時以60個堿基/秒的速率整合核苷酸，并可以擴增高達5kb的模板，使其適用于無特殊要求的標準PCR。引物：DNA聚合酶需要短序列的核苷酸，以指示它們需要在哪里開始擴增。在PCR中，這些序列稱為引物，是單鏈DNA的短片段（約15-30個堿基）。脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：是合成DNA新鏈的基礎，包括四個基本DNA核苷酸（dATP，dCTP，dGTP和dTTP）。PCR緩沖液：PCR緩沖液可確保在整個PCR反應過程中保持比較好條件。PCR緩沖液的主要成分包括氯化鎂（MGCl2，充當DNA聚合酶的輔助因子），tris-HCl和氯化鉀（在反應過程中保持穩定的pH值）。目前市面上已經有很多成熟的包含PCR緩沖液的Taq聚合酶。根據qPCR擴增曲線整體趨勢，整個擴增過程主要分為四個時期，基線期、指數增長期、線性增長期和平臺期。準確qPCR儀采購

由于qPCR的高靈敏性，陰性對照有出現擴增信號的情況，那么在針對這類問題時，我們需要判斷其原因所在。準確qPCR儀采購

制備DNA——解交聯和DNA純化現在含有目標蛋白質的染色質片段已分離，需要解交聯并純化DNA。解交聯通常采用高熱孵育和/或消化來完成。注意：此時可以停止ChIP。經過解交聯和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲存。定量DNA——測定目標蛋白質-DNA水平在該步驟中，通過qPCR定量純化的DNA產物，通過qPCR，您可以確定目標蛋白是否存在于特定位點。ChIP的qPCR如何定量分析ChIP-qPCR 數據需要針對可變性來源進行標準化，包括染色質數量、免疫沉淀的效率（富集效率）和 DNA 回收率。兩種常用的標準化 ChIP-qPCR 數據方法——Percent Input法和富集倍數法（Fold Enrichmen）。與input相關的ChIP-qPCR數據包括ChIP的背景水平和input染色質的標準化。建議ChIP 實驗重復，盡可能將結果與背景信號和標準誤差一起顯示。準確qPCR儀采購

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