我們知道WB實驗步驟繁瑣，一次實驗歷時也不短，從提蛋白到顯影結束可能要三天，我們就講一下這里面的一些關鍵環節。一、蛋白提取及變性1、提取蛋白很多經驗豐富的WB實驗者都深有體會，蛋白提取是影響結果重要的環節之一。該過程重要的是防降解和保證蛋白濃度不要太低。防降解主要有兩點，一是裂解前注意保持樣品處于低溫環境中，二是裂解時加入足夠的蛋白酶抑制劑。我們習慣先用冰冷的PBS做心臟的體循環灌注，然后冰上取腦，分離各腦區(嗅球，皮層，海馬，中腦，小腦，延髓，丘腦，紋狀體)后置于，用液氮速凍后轉移至-80度冰箱長期保存。接著是保證蛋白濃度，即要加入適量的裂解液，加太少會使蛋白提取不充分，加太多會讓蛋白濃度太低，一般經驗是這樣的，細胞樣品例如一個六孔板的細胞加60微升的裂解液，動物組織的話每毫克組織加10微升裂解液。還要加上超聲破碎處理，具體方案見討論部分。如果沒有超聲破碎儀，那就用1毫升注射器不斷抽吸，冰上反復抽吸1分鐘左右，注意不要產生過多氣泡。(需要灌注取材的視頻可以私聊獲取，由于文件過大，又比較血腥，不宜直接放到文章里。)2、蛋白變性加入上樣緩沖液后100攝氏度煮10分鐘，這里的上樣緩沖液有兩種可選。可以嚴格控制實驗條件，增強實驗材料的可比性。北京豚鼠動物模型構建

動物疾病模型在人類重大疾病研究和新藥創制等方面具有不可替代的重要作用和價值。與自發性疾病動物模型和環境誘導、物理因素、藥物誘導的疾病動物模型相比，手術模型操作復雜、技術門檻高，因此也存在相應的一些問題，如缺乏標準化流程、穩定性差、實驗室之間數據可比性較差。即便是同一個實驗室，重復性也是一個很大的挑戰。所以實現手術疾病模型的標準化、規范化和重復性仍然是該領域長期的目標。針對這一現狀，賽業生物利用多年積累的的堅實經驗、高效的團隊組建及管理經驗，歷經兩年籌備，打造了一支技術過硬的小鼠手術模型服務團隊，熟練掌握多種模型的制備，具備建立復雜及復合手術疾病模型的能力。我們以項目“可重復”作為金標準，對于客戶復雜的項目需求或文獻未見、少見的疾病模型，我們會與客戶緊密協作，認真理解和把握需求，制定科學合理的手術模型造模方案。希望我們提供的專業且穩定的手術模型服務可以節省您的時間和精力，讓您可以聚焦到科學創新性的工作上來。服務優勢1.以實驗“可重復”作為服務標準我們以實驗“可重復”作為金標準，對技術團隊進行大量的手術模型操作訓練，確保疾病模型多個批次之間數據的穩定性。2.一站式服務。寧夏大鼠動物模型造模肺泡上皮細胞及內皮損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致的急性低氧性呼吸功能不全。

導師給我們上的堂課往往就是交代我們要詳細記好實驗記錄，只要是和實驗相關的，無論是照片，還是文字，必須要及時事無巨細地詳細記錄。并且要備份好每一份實驗記錄。我個人一般喜歡每天及時地記在「科研實驗記錄本」上面，然后拍照掃描成電子版儲存在電腦和云端。時間規劃首先，個人是不贊同每天24小時泡在實驗室的，高效率是關鍵。建議提前一天規劃好第二天需要做的事情，按照代辦事項的格式逐條列出，哪一個時間段需要做什么事情？這樣的好處有兩點，一個是自己提前把時間預約好，可以留出足夠的時間休息和娛樂；另一個是在執行計劃的時候往往會有一種時間緊迫感，辦事起來往往更高效且不會遺漏。總之，預實驗就是迷你版正式實驗，希望小伙伴們在進行預實驗的時候一定要盡可能地準備周全，這樣才能快的推進正式實驗。

然后再入固定液，但要注意防止組織損傷。要熟悉采集部位。要能準確的按解剖部位采集，如胰腺，一般取胰島較多的胰腺尾部；肺應取有細支氣管及帶有軟骨片的小支氣管部。如果實驗需進行多組織樣本的采集，采集順序應按照：消化，神經系統，皮膚，肌肉等的順序進行。選好組織塊的切面。熟悉某些組織成分安排，然后決定其切面的走向；如一長管狀以橫切面較好。切除不需要的部分。特別是組織周圍的脂肪等，應盡可能掉，否則給固定、脫水、浸蠟、切片等帶來一些不必要的問題。組織樣品的固定（1）固定的方法：①小塊組織固定法：從動物取下的小塊組織，立即置入液態固定劑（這是應用經常的方法）。②注射/灌注固定法：某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內部或需要對整個臟器或整個動物進行固定，這時宜采用注射固定法，將固定液注入血管，經血管分支到達整個組織和全身，從而得到充分的固定。另，空腔組織比如肺，肺內含有空氣，固定液難以滲入，建議先做肺灌注，使得肺充盈滿固定液以后再進行保存，如果空腔中氣體沒有有效排出，后續可能影響固定效果（沒有灌注的肺組織會浮在液體表面不利于固定，切片以后也會看到很多的空泡）。③蒸汽固定法：比較細小而薄的標本。面神經受損而致面部表情肌群的運動功能障礙,對患者的心理和日常生活造成很大的影響。

伴vonFreyhairs檢測）熱板法大/小鼠甩尾法大/小鼠熱輻射致痛法大/小鼠壓痛法大/小鼠VonFreyhairs法大/小鼠醋酸扭體法小鼠福爾馬林致痛法大/小鼠佐劑CFA引起的疼痛大/小鼠角叉菜膠致痛模型大/小鼠LPS誘導痛模型大/小鼠脊神經選擇性結扎（L5/L6）大/小鼠坐骨神經分枝選擇性損傷模型（SNI）大/小鼠糖尿病疼痛、切口疼痛，性疼痛模型大/小鼠抗癡呆小鼠獲得性記憶障礙模型（6道小鼠跳臺視屏分析系統）小鼠小鼠記憶鞏固不良模型（6道小鼠跳臺視屏分析系統）小鼠小鼠記憶再現障礙模型（6道小鼠避暗視屏分析系統）小鼠小鼠明暗箱法（4道小鼠明暗箱視屏分析系統）小鼠大鼠獲得性記憶障礙模型（Morris水迷宮視屏分析系統）大鼠小鼠腦內乙酰膽堿酯酶活力測定小鼠D-半乳糖致小鼠癡呆模型小鼠新物體識別實驗大鼠APP/PS1雙轉基因小鼠模型（Morriswatermaze,CognitionWall）轉基因小鼠體外實驗細胞水平。通過建立腦缺血-再灌注動物模型，模擬人類ICVD的病理過程。小鼠動物模型手術

可以克服人類某些疾病潛伏期長，病程長和發病率低的缺點。北京豚鼠動物模型構建

根據gm20541的cdna序列設計引物：gm20541-cdna-f：5’-tcggtctcatcttcattccc-3；gm20541-cdna-r：5’-ggaaggctctgttccggtat-3；(g)以提取的cdna為模板，進行rt-pcr。擴增后進行電泳。結果見圖4中b，可以看出，通過rt-pcr方法檢測gm20541在gm20541基因敲除純合子小鼠的視網膜中表達量降低。圖4的b中ctrl是指野生型對照，sixko是指gm20541基因敲除純合子小鼠；gm20541rnalevel是指rna表達水平相對變化，以野生型表達水平為1。實施例3對4月齡的gm20541基因敲除純合子小鼠進行erg視力檢測：1暗適應動物應整夜暗適應，環境應做到沒有光線；2次日麻醉：稱重，腹腔內注射；宜深度麻醉；3動物固定及散瞳：麻醉完成后，在暗紅光照明下將小鼠用膠帶固定在動物試驗平臺的前方：需保證小鼠正"趴"，即相對于閃光刺激器的刺激口，雙眼高度一致，充分暴露，滴加散瞳劑。4電極安裝：將視網膜電圖儀(espionvisualelectrophysiologysystem,diagnosysllc,littleton,ma,usa)預熱后，在耳夾電極涂上導電膏，夾尾巴，插入放大器“地”接口；雙頭的針電極插入后頸皮(大約在兩耳中間)，同時接兩個通道的“負”接口；金環電極夾在動物實驗平臺的電極支架上，仔細調整其角度。北京豚鼠動物模型構建