[1]細胞培養(yǎng)營養(yǎng)條件1．培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)基包含細胞生長所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，包括碳水化合物、氨基酸、無機鹽、維生素等。針對不同細胞的營養(yǎng)需求，有多種合成培養(yǎng)基可供選擇，如EBSS、Eagle、MEM、RPMll640、DMEM等。2．其他添加成分在各種合成培養(yǎng)基提供基礎營養(yǎng)物質(zhì)之外，還需根據(jù)不同細胞和不同的培養(yǎng)目的添加其他成分，如血清、因子等。血清提供的是細胞外基質(zhì)、生長因子和轉鐵蛋白等重要物質(zhì)，常用的是胎牛血清。要根據(jù)不同的細胞和不同的研究目的決定添加血清的比例。10%～20%的血清能維持細胞較快的生長增殖速度，稱為生長培養(yǎng)液；為維持細胞緩慢生長或不死，添加2%～5%的血清即可，稱為維持培養(yǎng)液。但血清中也存在有害于細胞生長和繁殖的物質(zhì)，如補體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子；成分不明確，影響對結果的分析；不同動物、不同批次的血清活性差別較大，影響培養(yǎng)效果的穩(wěn)定性。谷氨酰胺是細胞生長重要的氮源，在細胞生長代謝過程中起重要作用，但由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，故谷氨酰胺需在使用前添加。為防止污染，培養(yǎng)基中還需添加一定量的常用名稱、濃度及敏感性如下表。人臍動脈內(nèi)皮細胞，Human Umbilical Artery Endothelial Cells。上海疾病模型原代細胞

易操作原代細胞和細胞系的比較3.原代細胞的應用由于原代細胞生物學特性未發(fā)生很大改變，接近和反映體內(nèi)生長特性，因此是：(1)研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的工具；(2)更好實現(xiàn)醫(yī)療的診治模式，實現(xiàn)個體化用藥的目的。第二部分：原代細胞分離和培養(yǎng)技術原代培養(yǎng)的原理將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶/膠原酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。主要包括取材——分離——培養(yǎng)等3部分；在原代細胞應用較多的包括：組織（如實體瘤、皮膚等）、懸浮細胞的取材等。下面依次介紹：一、組織的取材病人自體的原代細胞由于更接近臨床患者標本，可以更好實現(xiàn)醫(yī)療的診治模式，實現(xiàn)個體化用藥的目的。所以對病人自體細胞體外分離與培養(yǎng)十分必要?；具^程如下圖所示：原代細胞的分離步驟備注：上圖細胞為肉瘤患者的原代細胞具體步驟如下：1.在無菌條件下的冰上對新鮮離體的組織，剔除包膜及壞死組織，無菌PBS清洗3-5次；切成約1mm3組織塊；2.加入2mmol的EDTA，搖勻后放置冰上約30-60min；3.離心，并加入膠原酶消化（含蛋白酶）；4.消化期間。疾病模型原代細胞分離人臍靜脈內(nèi)皮細胞分離自臍帶靜脈，一般用于生理學和藥理學研究。

原代細胞的優(yōu)勢與不足細胞培養(yǎng)很好的補充了體內(nèi)實驗的不足，它讓細胞功能和進程的研究更具可操作性。細胞系的一個缺點是它們往往與原始的組織有不一樣的遺傳和表型。相比之下，原代細胞保持了細胞在體內(nèi)的許多重要標志和功能。原代細胞的生長：雖然原代細胞有諸多優(yōu)點，但是獲得高純度的原代細胞是一個非常艱巨的過程。比起細胞系，原代細胞可謂是極其敏感，需要額外添加經(jīng)典培養(yǎng)基所沒有的營養(yǎng)。原代細胞要在專為每種細胞定制的特殊培養(yǎng)液中存活和生長。例如內(nèi)皮細胞與上皮細胞或神經(jīng)元營養(yǎng)需求就大為不同。因此需要特殊培養(yǎng)基。傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)基靠血清提供生長因子、脂類和其他未知成分供細胞生長。但高血清會導致原代細胞分化或助長成纖維細胞等污染。此外，使用血清還會顧慮費用增高和批次差異等問題。使用低血清或無血清的特殊成分培養(yǎng)基不僅可以避開這些問題，還能更好的促進原代細胞的生長。另外，將原代細胞接種在生理親和性的基板上可以顯著提高細胞貼壁率、生長狀態(tài)和純度?；虮磉_分析：基因表達直接影響細胞功能，基因表達分析對研究原代細胞起重要作用。傳統(tǒng)的報告基因檢測和cDNA芯片方法往往需要轉染或大量高質(zhì)量RNA。但是原代細胞是出了名的難轉染。

又稱螯合劑，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好。與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物后，形成的機械力可使細胞分散。Q：細胞量太少，長不起來怎么辦？A：有幾種辦法，如對沒消化完的組織塊反復消化，盡量多收集一些細胞；并且盡量傳代到小皿里，如6孔板都可以。若是細胞仍太少，應耐心等待，盡量不要傳代，只換液。Q：細胞難以貼壁？A：盡快使接種的細胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關鍵。為了盡快促進細胞貼壁，可以提前1h將千分之的明膠鋪于培養(yǎng)板。Q：原代細胞培養(yǎng)方法與細胞系不同之處在哪里？A：培養(yǎng)基一般選用RPM1640，DMEM等，建議能加入促生長的物質(zhì)：如胰島素、氫化可的松、EGF等因子。二、原代正常組織分離皮膚是人體長久以來，表皮細胞一種被認為是難以培養(yǎng)的細胞，限制了皮膚生物學基礎研究的發(fā)展。作為表皮的主要細胞，角質(zhì)形成細胞已經(jīng)成為我們了解皮膚生物學至關重要的許多原創(chuàng)性研究的焦點。下面就介紹下小鼠角質(zhì)形成細胞的分離和培養(yǎng)。基本過程如下圖：原代小鼠角質(zhì)細胞的分離步驟實驗結果：分離出的小鼠角質(zhì)細胞常見問題解答：Q：皮膚組織作為正常組織，組織分離主要區(qū)別在哪里？A：首先，皮膚組織需要用中性分離酶dispaseII將表皮分離出來；其次。細胞形態(tài)：細胞梭形，不規(guī)則，貼壁培養(yǎng)。

使得每個內(nèi)箱盒2都處于密封的狀態(tài)，防止外部污染因素的干擾。如圖5所示，，為方便使用者鎖緊或打開內(nèi)箱盒2，所述鎖扣24包括鎖環(huán)241及鎖塊242，所述鎖環(huán)241與上蓋22活動連接，所述鎖塊242設于底盒21外部，所述鎖環(huán)241套設于鎖塊242上。當需要鎖緊內(nèi)箱盒2時，只需將鎖環(huán)241活動轉動，然后套設在鎖塊242上即可，簡單方便。如圖1所示，進一步的，為方便使用者移動外箱體1，所述外箱體1的底部還設有若干萬向腳輪12。本實施例中，外箱體1的底部設有4個萬向腳輪12，各萬向腳輪12分別設于外箱體1底部的四個角上。如圖1所示，更進一步的，為方便推拉外移動外箱體1，所述外箱體1的側部還設有方便推拉的扶手13。使用者手持扶手13，利用萬向腳輪12移動外箱體1的位置，簡單方便。采用上述各個技術方案，本實用新型通過將細胞培養(yǎng)皿存放在內(nèi)箱盒內(nèi)，在外箱體的矩形槽設置若干層對稱的滑槽，各內(nèi)箱盒可從滑槽的正面或背面存放于內(nèi)，提高了細胞培養(yǎng)箱的空間利用率；在內(nèi)箱盒內(nèi)設有紫外燈，紫外燈單獨照射于內(nèi)箱盒，使得細胞培養(yǎng)皿處于無菌無毒的環(huán)境，提高細胞培養(yǎng)的存活率；在內(nèi)箱盒的兩側分別設有滑輪及滑塊，滑輪的設置使得用戶可方便存取內(nèi)箱盒內(nèi)的細胞培養(yǎng)皿。人臍動脈內(nèi)皮細胞分離自臍帶動脈，一般用于生理學和藥理學研究。寧夏組織原代細胞培養(yǎng)

將動物某組織在合適的操作中培養(yǎng)出特定細胞，使得目的細胞得以生存、生長和繁殖，稱為原代細胞分離培養(yǎng)。上海疾病模型原代細胞

4、凍存的細胞該如何開始培養(yǎng)？(1)將一管細胞從液氮罐中取出，注意保護手和眼睛。(2)將凍存管快速的放入37℃水浴中，輕輕握住并旋轉，直到管內(nèi)物體完全融化。(3)將凍存管立即從水浴中拿出，擦干，轉入無菌環(huán)境。(4)用70％的酒精沖洗凍存管，然后擦去多余酒精。(5)打開蓋子，注意手指不要碰到里面的螺紋（注意，由于凍存管有負壓，開蓋時可能會有少量溢出，這是正?，F(xiàn)象）。(6)用多聚賴氨酸（或參照說明書）包被培養(yǎng)瓶。多數(shù)細胞推薦的接種密度為每平方厘米5000個細胞。(7)蓋好培養(yǎng)瓶的蓋子，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶以使細胞分布均勻。若需要氣體交換可打開蓋子。(8)將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2，95%空氣）(9)放入培養(yǎng)箱后第6-16小時更換一次培養(yǎng)基，以去除殘留的二甲基亞楓和未貼壁的細胞。5、細胞培養(yǎng)過程中，多久更換一次培養(yǎng)基？這取決于細胞生長的速度。一般而言2-3天更換一次培養(yǎng)基，許多細胞培養(yǎng)實驗室通常在周一，周三，周五更換培養(yǎng)基。注意：凍存細胞復蘇后，在6-16小時內(nèi)更換培養(yǎng)基，以去除殘留的二甲基亞楓和死亡的細胞。6、我能擴增培養(yǎng)和再次凍存原代正常人類細胞嗎？這取決于細胞的類型。一些細胞類型像神經(jīng)細胞，神經(jīng)膠質(zhì)細胞和一些生長緩慢的上皮細胞。上海疾病模型原代細胞