RNA甲基化修飾（m6A）研究RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上為普遍的修飾。目前發(fā)現(xiàn)microRNA，circRNA,rRNA,tRNA和snoRNA上都有發(fā)生m6A修飾。m6A修飾主要發(fā)生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“編碼器(Writer)”、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定[1]。“編碼器(Writer)”即甲基轉(zhuǎn)移酶，目前已知這個(gè)復(fù)合物的成分有METTL3，METTL14,WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（消碼器）可逆轉(zhuǎn)甲基化；m6A由m6A結(jié)合蛋白識(shí)別，目前發(fā)現(xiàn)m6A結(jié)合蛋白（讀碼器）有YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（包括YTHDF1,YTHDF2,YTHDF3，YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和HNRNPC）。m6A酶系統(tǒng)METTL3是早先被鑒定為結(jié)合SAM的組件，其缺失引起小鼠胚胎干細(xì)胞、Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中m6Apeaks的減少。METTL3及其同源蛋白METTL14定位在富含剪切因子的細(xì)胞核內(nèi)亞細(xì)胞器－核小斑（Nuclearspeckle）上，顯示ｍ６Ａ修飾可能和ＲＮＡ的剪切加工相關(guān)。WTAP與METTL3–METTL14二聚體相互作用，并共定位于核小斑，影響甲基化效率，參與mRNA剪。而KIAA1429作為候選的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的新亞基。由于大部分研究使用到的是人類來(lái)源的細(xì)胞，種植到免疫正常的動(dòng)物體內(nèi)會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。天津大鼠科研技術(shù)服務(wù)服務(wù)

注意事項(xiàng)1.病毒包裝的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)主要包括：細(xì)胞因素、載體系統(tǒng)(盡量使用成熟的商業(yè)化載體系統(tǒng))、構(gòu)建重組的質(zhì)粒正確與否、質(zhì)粒抽提純化情況、包裝轉(zhuǎn)染控制(24、48小時(shí)的細(xì)胞及熒光狀態(tài)判斷)、目的基因?qū)Σ《景b影響(基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會(huì)影響到是否能包裝成功)。，需要觀察包裝病毒后的48h培養(yǎng)基顏色是否橙紅。3.病毒濃縮：病毒一般在48h和72h各收一次。如果不想濃縮病毒的話，也可以直接將收集的病毒上清作為要的細(xì)胞的培養(yǎng)基，但是可能效果會(huì)不太好。并且一般收病毒時(shí)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)已經(jīng)損耗了很多，那樣直接培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)損害細(xì)胞，所以建議還是進(jìn)行濃縮后再。常見(jiàn)問(wèn)題1.包裝病毒時(shí)293T細(xì)胞狀態(tài)不好，或者鋪得過(guò)密，可以選擇放棄該次實(shí)驗(yàn)。2.目的載體過(guò)大，不易。3.避免轉(zhuǎn)染過(guò)程以及后續(xù)過(guò)程出現(xiàn)的污染。湖南模式科研技術(shù)服務(wù)構(gòu)建protocol 分享｜小鼠卵巢組織切片 HE 染色。

在人類疾病研究中數(shù)據(jù)表明，常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型按產(chǎn)生原因分為以下5類：自發(fā)性動(dòng)物模型、誘發(fā)型動(dòng)物模型、遺傳工程動(dòng)物模型、生物醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型和陰性動(dòng)物模型。下面上海研錄帶大家一起看看吧：1、自發(fā)性動(dòng)物模型：是指動(dòng)物未經(jīng)任何有意識(shí)的人工處理，在自然條件下或基因突變條件下所產(chǎn)生的疾病模型。主要包括突變型的遺傳病模型和近郊系的疾病模型。2、誘發(fā)型動(dòng)物模型：亦稱實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型。是使用物理、化學(xué)或生物致病因素誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生某些類似人類疾病表現(xiàn)而制備的動(dòng)物模型。此模型具有制備方法簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件容易控制，重復(fù)性好等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于藥物篩選、毒理、傳染病、病理機(jī)制的研究。3、遺傳工程動(dòng)物模型：是利用遺傳工程技術(shù)對(duì)動(dòng)物基因組進(jìn)行修飾，用于研究基因功能或疾病機(jī)制的動(dòng)物模型。也稱基因修飾動(dòng)物模型，是指利用胚胎工程和基因工程等生物技術(shù)有目的的干預(yù)動(dòng)物的遺傳組成，導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)新的性狀，并使其能夠有效地遺傳下去，形成新的可供生命科學(xué)研究的和其他目的所用的動(dòng)物模型。4、生物醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型：也是指利用健康生物的特定生物學(xué)特征，研究人類疾病相似表現(xiàn)得模型。這類動(dòng)物模型與人類疾病存在一定的差異，研究者應(yīng)加以比較，從中獲得有關(guān)材料。

外泌體的功能外泌體可能作為細(xì)胞之間物質(zhì)和信號(hào)通訊的途徑，不同的細(xì)胞通過(guò)分泌攜帶不同組分的外泌體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間通訊，這些外泌體被受體細(xì)胞吸收，通過(guò)物質(zhì)交換或釋放內(nèi)含物實(shí)現(xiàn)物質(zhì)和信號(hào)的交流。外泌體與受體細(xì)胞的信息交流可能通過(guò)以下4種途徑實(shí)現(xiàn):外泌體表面膜蛋白質(zhì)被目的細(xì)胞表面的受體識(shí)別，從而靶細(xì)胞;外泌體在蛋白酶作用下產(chǎn)生的表面膜蛋白質(zhì)碎片可作為目的細(xì)胞表面受體的配體;外泌體脂膜可以與目的細(xì)胞膜融合，將蛋白質(zhì)和RNA等內(nèi)容物釋放進(jìn)去，此類膜融合可能改變靶細(xì)胞的一些膜特性，例如脂質(zhì)和膜蛋白質(zhì)的密度及種類;目的細(xì)胞通過(guò)胞吞的形式攝入外泌體經(jīng)由以上幾種途徑，外泌體將其攜帶的生物信息運(yùn)輸?shù)街苓叞屑?xì)胞或經(jīng)血液等體液運(yùn)輸而被遠(yuǎn)處組織細(xì)胞攝取，進(jìn)而影響目的細(xì)胞的基本功能和基因表達(dá)。幾乎所有的細(xì)胞都可以在自發(fā)或在一定刺激條件下產(chǎn)生外泌體，不同的細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體具有不同的功能，這些外泌體參與了一系列生理和病理過(guò)程，如發(fā)生與發(fā)展、抗原呈遞、免疫調(diào)節(jié)、組織愈合等。此外，外泌體與疾病的研究表明：外泌體可能在代謝性疾病的出現(xiàn)以及心血管健康中發(fā)揮作用。干貨分享｜選對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用培養(yǎng)基DMEM和1640。

METTL3能夠促進(jìn)肺腺細(xì)胞的生長(zhǎng)、生存和侵襲，但還不清楚它是否作為m6A調(diào)節(jié)器或效應(yīng)器發(fā)揮作用[25]。在急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）患者中，m(6)A調(diào)控基因的突變或拷貝數(shù)變化與TP53突變存在密切聯(lián)系，且m(6)A調(diào)控基因的改變與AML不良預(yù)相關(guān)[26]。此外，F(xiàn)TO在AML中高表達(dá)，它通過(guò)降低mRNA轉(zhuǎn)錄本中的m(6)水平，調(diào)節(jié)ASB2和RARA等靶點(diǎn)的表達(dá)，增強(qiáng)了白血病基因介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和白血病形成，并抑制全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)的AML細(xì)胞分化[27]。在脂肪形成過(guò)程中，F(xiàn)TO表達(dá)與m6A水平成負(fù)相關(guān)，促進(jìn)脂肪形成[3]。在膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣細(xì)胞中，ALKBH5通過(guò)lncRNAFOXM1介導(dǎo)FOXM1基因pre-mRNA上的m6A修飾維持膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成瘤性[28]。此外，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3或METTL14的敲除，能夠改變m6A的富集和ADAM19的表達(dá)，極大地促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、自我更新和形成[29]。圖2m6ARNA修飾和介導(dǎo)的功能[30]m6A的研究方向主要是通過(guò)研究m6A修飾相關(guān)的甲基化、去甲基化酶和識(shí)別蛋白的功能，進(jìn)而研究m6A修飾的生物學(xué)功能和作用機(jī)制：一般通過(guò)敲除m6A酶分子，研究下游功能基因分子的表達(dá)和m6A甲基化情況，通過(guò)介導(dǎo)相關(guān)基因異常（可變剪切、穩(wěn)定性、翻譯、miRNA調(diào)控）影響細(xì)胞表型和功能特征。細(xì)胞轉(zhuǎn)染又分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是指外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后.北京大鼠科研技術(shù)服務(wù)購(gòu)買

動(dòng)物疾病模型可以分為兩種類型：自然模型和人工模型。天津大鼠科研技術(shù)服務(wù)服務(wù)

把膜先用TBST泡洗兩遍再用5%脫脂奶粉或者BSA室溫封閉1-2小時(shí)。注意一定要讓蛋白面充分接觸封閉液。2、孵一抗脫脂奶粉封閉的話，要用TBST泡洗三遍再轉(zhuǎn)移至一抗溶液中，BSA封閉的可以直接轉(zhuǎn)移至一抗中。如果膜的寬(膜是一個(gè)長(zhǎng)方形，這里的寬與長(zhǎng)相對(duì)應(yīng))不大于8毫米，我習(xí)慣置于15毫升離心管中孵育，兩條膜"背對(duì)背"式放置于一個(gè)管子里(3毫升液體即可)。如果大于8毫米，就用普通的5格的一抗孵育盒(4毫升即可)。4度過(guò)夜，一般是12-18個(gè)小時(shí)，注意放置水平，用搖床。內(nèi)參等蛋白豐度很高的如果孵久了可能出現(xiàn)條帶連在一起的情況，這時(shí)可以縮短孵育時(shí)間或者降低一抗的濃度。六、孵二抗顯影1、孵二抗室溫一個(gè)小時(shí)足矣。這步要注意的是建議用5%BSA或者脫脂奶粉稀釋二抗，這樣背景會(huì)干凈許多。也要注意膜的蛋白面要充分接觸二抗溶液，我們一般一條膜一個(gè)槽地孵。2、顯影這一步有個(gè)細(xì)節(jié)可能有些同學(xué)沒(méi)注意到，就是ECL發(fā)光液要與HRP反應(yīng)一分鐘后顯影效果才會(huì)更好，還有要注意的是顯影液要均勻覆蓋，一般第二次顯影(加新的顯影液)比一次好看。天津大鼠科研技術(shù)服務(wù)服務(wù)