靜置25分鐘后把酒精倒干，用吸水紙吸出多余的酒精，然后配壓縮膠，同樣的操作，關(guān)鍵是梳子要插得快，要小心梳子下產(chǎn)生氣泡，然后靜置30分鐘。如果是當天跑膠，我會等上層膠凝2個小時再用，但要注意防干燥縮水，可以在一個小時的時候沿著梳子上緣加點電泳液。所以我一般提前一晚制膠，泡于純水或者電泳液里置于4度冰箱暫存。三、蛋白電泳1、上樣前準備把膠組裝到電泳芯上，注意密閉性(否則漏液)，如果內(nèi)槽漏液就不是勻強電場了，條帶可能就不是一條直線。然后內(nèi)槽倒?jié)M電泳液，拔梳子，這一步要小心，梳子要兩邊一起緩緩?fù)习纬觯缓笥^察泳道內(nèi)有無脫落的膠粒或者膠絲，有的話用1毫升注射器吸出。然后從冰箱取出蛋白樣品，解凍。準備振蕩器。2、上樣和電泳注意，上樣后蛋白會開始慢慢在膠中彌散，所以上樣越快越好。我習(xí)慣先上蛋白Marker,再上蛋白樣品，蛋白上樣前確保樣品完全解凍和充分振蕩(推薦使用振蕩器振蕩)，吸的時候沒有拉絲即可，建議上樣分鐘把樣品從冰上取出來，不然樣品中SDS可能會結(jié)晶析出，從而影響電泳效果。上層膠80V25分鐘，下層膠120V65分鐘。四、轉(zhuǎn)膜1、轉(zhuǎn)膜前準備我會在電泳結(jié)束0分鐘準備，把轉(zhuǎn)膜液配好置于4度冰箱預(yù)冷，然后裁膜，準備轉(zhuǎn)膜裝置。純干貨Western blot （WB）條帶灰度統(tǒng)計與GraphPad作圖.河北乳鼠科研技術(shù)服務(wù)外包

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固定的目的①保持其原有狀態(tài)：使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，迅速防止、細胞的死后變化，防止自溶與，防止細胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)，使之盡量保持生前的狀態(tài)和結(jié)構(gòu)。②以便染色后易于鑒別和觀察：不同成分對染料有不同的親和力，以便染色后易于鑒別和觀察。③使塊硬化，便于制作薄片（塊在脫水、包埋、切片、染色等過程中不易損壞）。（3）固定液固定液種類：一類是單純固定液，即只有一種試劑；另一類是混合固定液，由兩種或兩種以上試劑組成。作為較好的固定液，應(yīng)有下列特性，首先，有強滲透力，能迅速的滲入內(nèi)部；其次，不使過度收縮或膨脹，并能使內(nèi)欲觀察的成分得以凝固為不溶性物質(zhì)；能使達到一定的硬度并獲得較佳的折光率和對某些染料具有較強的親和力。固定液通常使用10%的甲醛溶液。特殊要求的，常需要特殊的固定液，取樣之前應(yīng)做好準備。如眼球樣本應(yīng)使用FAS眼球固定液，脂肪應(yīng)使用脂肪固定液等。此外，在進行骨樣本制備的時候，還應(yīng)注意提前進行脫鈣處理，可根據(jù)具體情況選擇慢脫鈣或快脫鈣處理。總的來說，樣品的采集是實驗中至關(guān)重要的一環(huán)，如果取樣環(huán)節(jié)出現(xiàn)了偏差，往往會導(dǎo)致后續(xù)檢測結(jié)果的偏移。

應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明，否則切片難以鏡檢。（4）二甲苯應(yīng)盡量保持無水，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。5.透蠟注意事項（1）透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據(jù)組織大小而定。（2）盡量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度。（3）透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低。（4）操作要迅速，力求在短的時間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。（5）注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。6.染色水洗注意事項（1）染色原理：伊紅主要染細胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對比。（2）染色時間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。（3）注意流水不能過大，以防切片脫落。（4）如果細胞核染色較淺，細胞質(zhì)也應(yīng)淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。科研技術(shù)服務(wù)的價值在于將科研成果轉(zhuǎn)化為實際應(yīng)用，推動社會進步與發(fā)展。

m6A研究又有新手段了？趕緊來了解一下吧！欄目：研究動態(tài)發(fā)布時間：2019-08-14RNA甲基化m6A是如今的研究熱點之一,Cell上新發(fā)表了一篇介紹不使用m6A抗體的檢測mRNAm6A水平的Resource文章......RNA甲基化m6A是如今的研究熱點之一，目前主要的研究思路包括差異表達的write，reader和eraser基因分析；m6A抗體檢測全轉(zhuǎn)錄組甲基化水平；分析m6A甲基化水平變化的靶基因和下游機制研究。而在7月25日的Cell上新發(fā)表了一篇介紹不使用m6A抗體的檢測mRNAm6A水平的Resource文章，小編時間和大家分享一下。作者開發(fā)這一方法的前提是有研究報道了MazF能特異性的識別無修飾的ACA序列并發(fā)揮RNA酶活性在ACA之前剪切底物。但ACA序列的個A發(fā)生m6A甲基化之后將無法被MazF所識別，如圖一所示。圖1MazFRNA酶作用示意圖根據(jù)這一原理，作者將純化后的mRNA進行MazF酶處理，然后再對打斷的RNA進行逆轉(zhuǎn)建庫測序。對于無修飾的位點，ACA處被完全剪切，測序reads正好分布于該位點上下游而且比對至該處的上下游reads數(shù)是相同的.如圖2所示。而甲基化位點的reads會包含上下游的序列。作者開發(fā)了MAZTER-MINE軟件包專門進行分析（圖3）。希望能給大家提供到幫助，了解更多關(guān)于ELISA試劑盒的問題歡迎來電咨詢。寧夏外包科研技術(shù)服務(wù)購買

科普知識 —了解IgM、IgG、IgA、IgE四種抗體。河北乳鼠科研技術(shù)服務(wù)外包

圖2MAZTER-Seq實驗流程圖圖3MAZTER-MINE分析m6A示意圖接下來作者便是要驗證這一新方法的可行性了。在酵母中敲除IME4的情況下，檢測到的剪切效率高于野生型（剪切效率高低m6A水平），m6A抗體富集后的樣品剪切效率也低于未富集的Input組。整體水平可靠，那檢測的特異性位點是否準確呢？作者也將該方法檢測到的新甲基化位點使用放射標記層析檢測，發(fā)現(xiàn)預(yù)測的位點準確存在而且與剪切效率相符合。如圖5所示。而圖6中，作者則是與m6A抗體IP的方法進行了比較，也證實了這一方法的可行性。圖5MAZTER-Seq檢測結(jié)果驗證圖6MAZTER-Seq與m6A-Seq比較分析此外，后文中作者也在大規(guī)模的CRISPR-Cas9改變m6A狀態(tài)和酵母減數(shù)分裂模型中檢測了MAZTER-Seq這一系統(tǒng)；并進一步通過這一方法檢測了哺乳動物不同細胞間m6A水平的保守性；也探究了去甲基化酶FTO對整體m6A甲基化水平的影響等。這里小編主要給大家分享這一新技術(shù)，其他部分暫不過多分析了。新的技術(shù)能拓展我們的研究內(nèi)容；對于這一技術(shù)。河北乳鼠科研技術(shù)服務(wù)外包