且研究表明HNRNPC通過m6A與RNA結合調控目標轉錄本的豐度和選擇性剪切[9].圖1m6A修飾的酶系統[10]m6A生物學功能越來越多的證據表明m6A修飾在哺乳動物中發揮重要的生物功能。例如，在轉錄水平上調控RNA的穩定性[11]、定位[12]、運輸、剪切[13]和翻譯[14]。ClaudioR.等發現依賴METTL3的pri-miRNA甲基化，會促進DGCR8識別和加工，從而促進microRNA的成熟[15]。此外，m6A識別蛋白HNRNPA2B1促進pri-miRNA加工成pre-miRNA[16]。另外，環狀RNA上m6A的修飾能促進環狀RNA的翻譯[17]。m6A修飾在基因表達調控中起著重要的作用，其調控機制的異常可能與人類疾病或相關。目前發現m6A可能會影響精子發育（ALKBH5，METTL3，Ythdc2）、發育（METTL3、FTO、ALKBH5）、免疫（METTL3）、UV誘導的DNA損傷反應（METTL3，FTO）、生成（YTHDF2）或轉移（METTL14）、干細胞更新（METTL14）、脂肪分化（FTO）、生物節律、細胞發育分化、細胞分裂及其它的一些生命過程。例如，ALKBH5敲除的雄性小鼠增加了mRNA中的m(6)A修飾，其特點是凋亡影響減數分裂中期的精子細胞，引起生育能力受損[7]。METTL3和METTL14增加弱精癥精子的m6A水平[18]，在生殖細胞中，METTL3的敲除嚴重抑制精子分化和減數分裂的發生。將Transwell小室放入配套培養板中，形成由細胞可穿透性膜分隔開的兩室系統，將高營養液與低營養液分隔開。寧夏外包科研技術服務實驗

1.首要原則：細胞不重要情況下立即丟棄，培養箱滅菌，所用培養基也都要丟棄，器械等重新滅菌或拆用新的。2.細菌污染一般都救不回來了，發現的時候培養基一般都很渾濁且細胞都死了3.污染且細胞很重要時：遇到念球菌污染，且細胞為基因改造細胞，非常重要。如231貼壁乳腺細胞，發現細胞周圍出現很小的串珠透亮圓點，非常像念球菌污染，此時細胞狀態尚可，且污染少。處理如下：用預熱或室溫PBS清洗3次，可適當振搖，將污染沖洗下來。隨后加入10-20%雙抗到培養瓶，置于37度培養箱1h，之后再用PBS清洗三遍，直至視野下無可見污染。此時細胞也被沖下大部分，因此此方法只適用在細胞貼壁強，狀態好，密度高時使用。之后每天再更換培養基，每次用PBS沖洗2遍。過幾天細胞狀態尚可時，消化離心時用500r，3min，去掉上清，重復3次。這個方法是根據文獻可利用念球菌和細胞體積重量差異實現分離。基本上這一步做完以后，污染就基本了，接下來就注意多觀察，勤換液就行。湖南動物科研技術服務構建此外，動物模型的倫理問題也不容忽視，科研人員需要在符合倫理規定的前提下進行相關研究。

用伊紅乙醇液對比染色1~3min。（4）將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中3~5min，吸干后將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。3、觀察在鏡下可見卵巢呈扁橢圓形，表面為單層扁平上皮細胞或單層立方上皮，卵巢實質分為皮質和髓質。可見上皮，原始卵泡和生長卵泡。卵巢組織中各發育階段卵泡及卵巢基質的形態結構清晰可見,細胞核呈藍紫色,細胞質及間質成分呈淺紅色,卵泡中卵母細胞、卵泡細胞、透明帶均清晰可見。注意事項1.取材注意事項（1）取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結構等發生變化。（2）切片材料應根據需要觀察的部位進行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。（3）切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以5mmx5mmx2mm或10mmx10mmx2mm為宜。2.固定注意事項（1）一般固定液，都以新配為好，配好后應貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變化，失去固定作用。（2）有些混合固定液的成份之間會發生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。（3）固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應更換1~2次新液。（4）材料固定完畢后。

準備碎冰和。把膜置于甲醇溶液中活化1分鐘，然后轉移至轉膜液中平衡3分鐘后備用。2、轉膜組裝轉膜三明治夾，這一步很關鍵，重要的是膠和膜之間不能有氣泡且膜與膠要保證貼合緊密(否則會翻車)，可以加多點轉膜液泡著。組裝好后加滿轉膜液，設置電源參數，我習慣恒流轉膜，200-280毫安，1-2小時，根據分子量定，如50KD的分子用60分鐘就夠了。如果一個電源帶兩個轉膜大槽即四塊膠，我就會用恒壓70-110V。這個過程重要的是做好降溫。這里簡單說一下蛋白分子量與玻璃板厚度，分離膠的濃度，轉膜電源參數的選擇問題。如果是能用1毫米的玻璃板就不用，因為轉膜是在電場的作用下蛋白分子從膠上遷移到膜上，1毫米膠的蛋白遷移距離要比。選擇更薄的膠蛋白轉膜時間可以減少，從而減少發熱，以免膠變形，條帶也會更好看。然后是分離膠的濃度，如果是150—200KD的分子選10%以下的的分離膠，200—300KD的選8%的,300KD以上的選6%的，小于30KD的200mA30分鐘，30-100KD的按分子量的數值算，如70KD，250mA70分鐘;100-150KD的250mA100分鐘;150—300KD的分子轉膜條件用280毫安(以上均是對于，)，120分鐘足矣，前提是膠的濃度相適應。五、封閉孵一抗1、封閉轉膜結束后。通過對動物模型的研究，科研人員可以更清楚地了解疾病的發展過程和機制，為人類疾病的檢查提供理論依據。

首先，預實驗必須要當做正式實驗來對待（態度要放端正，這是必須的）。預實驗的每一步都需要詳細規劃，多方籌謀。不論是實驗動物的選擇，還是檢測試劑的購買，都盡量和正式實驗統一標準。建議大家先把所有試劑和藥物購買完畢后，再去購買實驗動物。因為動物會長胖，長胖后給藥劑量就要增加，不僅多花錢，并且還容易影響實驗效果。筆者曾經提前將實驗動物買回，但因為特殊原因沒能購買到造模藥物，**終只能忍痛割愛將動物贈送他人，白白虧了一筆血汗錢（那批老鼠在我這兒白吃白喝長得太胖，沒辦法用作造模）。動物及試劑購買首先需要考慮：實驗動物品種、體重、性別、周齡（通常根據既往文獻報道可以獲得答案）、數量（需要考慮到實驗有一定動物死亡率或者動物本身會打架互毆，因此需要提前購買足夠的動物）。動物購買的途徑、安置的地點，飲食管理（一般實驗室會有動物房，也可以從其他地方購買），動物免疫證明、倫理證明需要提前準備好。實驗相關的試劑和藥物：比如造模藥物和器械，動物干預所需藥物，陽***物選擇及購買（有些藥物購買很困難，必須通過特殊程序才能買到）。如果涉及到有創操作，要提前準備好**物（***建議提前購買），手術器械。動物模型的表現與人類疾病可能存在差異，因此需要謹慎使用。湖南動物科研技術服務構建

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