采用opti-MEM和Lipo3000分別轉染含有目的基因的pMSCV-eGFP、VSV、GAG質粒及對照載體，每皿加入脂質體-質粒轉染混懸液按購買脂質體相關說明書操作定量。繼續培養24h。2)24小時后，將培養基更換為新鮮的DMEM完全培養基，放進細胞培養箱繼續培養48~72h。3)48~72h后收集上層培養液，并過μm濾膜，采用ELISA法對所獲得的慢載體進行滴度測定。如不及時使用可以凍存于-80℃。3、慢轉染1)轉染前1天將細胞接種6孔培養板，時細胞的融合率約為50%，前需換液，加入1mLDMEM完全培養基。2)冰浴融化后加入相應體積的液及聚凝胺（Polybrene），混勻后放入37℃孵箱中繼續培養3)4h后補充1mL培養基，14h后換液（24h內換液即可）。4)72h后用倒置顯微鏡觀察熒光，監測效率，出現較多熒光時將等量的轉染細胞和未轉染細胞分別加入等濃度Puromycin（Puromycin或其他篩選濃度需要事先摸索）。5)待未轉染細胞全部死亡并且可觀察到滿意熒光量時，降低Puromycin濃度培養。也可以挑去單克隆細胞株進行進一步培養，以得到滿意的穩定表達目的基因的細胞株。6)使用qRT-PCR和Westernblot的方法檢測目的基因的表達量和蛋白水平是否顯著提高。7)由此可得三組細胞株：a.正常細胞株；b.空載載體的細胞株。實驗技巧——做好細胞凍存，保證細胞質量。天津豚鼠科研技術服務服務

    1.首要原則：細胞不重要情況下立即丟棄，培養箱滅菌，所用培養基也都要丟棄，器械等重新滅菌或拆用新的。2.細菌污染一般都救不回來了，發現的時候培養基一般都很渾濁且細胞都死了3.污染且細胞很重要時：遇到念球菌污染，且細胞為基因改造細胞，非常重要。如231貼壁乳腺細胞，發現細胞周圍出現很小的串珠透亮圓點，非常像念球菌污染，此時細胞狀態尚可，且污染少。處理如下：用預熱或室溫PBS清洗3次，可適當振搖，將污染沖洗下來。隨后加入10-20%雙抗到培養瓶，置于37度培養箱1h，之后再用PBS清洗三遍，直至視野下無可見污染。此時細胞也被沖下大部分，因此此方法只適用在細胞貼壁強，狀態好，密度高時使用。之后每天再更換培養基，每次用PBS沖洗2遍。過幾天細胞狀態尚可時，消化離心時用500r，3min，去掉上清，重復3次。這個方法是根據文獻可利用念球菌和細胞體積重量差異實現分離。基本上這一步做完以后，污染就基本了，接下來就注意多觀察，勤換液就行。上海血液科研技術服務外包此外，動物模型的倫理問題也不容忽視，科研人員需要在符合倫理規定的前提下進行相關研究。

    膿毒癥動物模型必須具備以下基本要素：有膿毒癥典型的高排低阻血流動力學表現和高代謝狀態；伴發多個功能障礙；有較高的自然死亡率，根據膿毒癥的轉歸，要求動物模型的自然死亡率達到50%～70%；膿毒癥是嚴重引起機體的炎癥反應過度造成的自身損傷，不是細菌和內對機體的直接損傷，故出現功能障礙及動物死亡距膿毒癥模型制備應有一定的時間間距。一般在制模后6～12h后發生的功能障礙或死亡屬全身炎癥反應所致。實驗動物的選擇在制作動物模型時多選用雄性小鼠，因為雌性小鼠較雄性小鼠更能耐受膿毒癥和失血性休克，且進入發期的雌性小鼠性水平變化很大，而雄性小鼠在膿毒癥時更易于發生免疫抑制。為什么選擇CLP模型？盲腸結扎穿孔模型（CLP）模型是接近于人類膿毒癥機制的模型，被稱為膿毒癥模型的“金標準”。CLP技術在20世紀70年代被建立。CLP模型非常適宜用于防治膿毒癥或膿毒性休克新藥的臨床前觀察造模方法CLP膿毒癥模型的建立主要分為兩個階段：盲腸遠端結扎和盲腸穿刺。首先是手術引發的結扎部位組織變性壞死引起局部炎癥反應，其次是穿孔后使糞便內容物漏入腹膜引起多菌性細菌性腹膜炎，進而誘發全身性炎癥反應。

    METTL3能夠促進肺腺細胞的生長、生存和侵襲，但還不清楚它是否作為m6A調節器或效應器發揮作用[25]。在急性髓細胞白血病（AML）患者中，m(6)A調控基因的突變或拷貝數變化與TP53突變存在密切聯系，且m(6)A調控基因的改變與AML不良預相關[26]。此外，FTO在AML中高表達，它通過降低mRNA轉錄本中的m(6)水平，調節ASB2和RARA等靶點的表達，增強了白血病基因介導的細胞轉化和白血病形成，并抑制全反式維甲酸(ATRA)誘導的AML細胞分化[27]。在脂肪形成過程中，FTO表達與m6A水平成負相關，促進脂肪形成[3]。在膠質細胞瘤樣細胞中，ALKBH5通過lncRNAFOXM1介導FOXM1基因pre-mRNA上的m6A修飾維持膠質瘤細胞的成瘤性[28]。此外，甲基轉移酶METTL3或METTL14的敲除，能夠改變m6A的富集和ADAM19的表達，極大地促進了膠質瘤細胞的生長、自我更新和形成[29]。圖2m6ARNA修飾和介導的功能[30]m6A的研究方向主要是通過研究m6A修飾相關的甲基化、去甲基化酶和識別蛋白的功能，進而研究m6A修飾的生物學功能和作用機制：一般通過敲除m6A酶分子，研究下游功能基因分子的表達和m6A甲基化情況，通過介導相關基因異常（可變剪切、穩定性、翻譯、miRNA調控）影響細胞表型和功能特征。EdU細胞增殖檢測是一種快速、準確、靈敏的細胞增殖檢測方法.

    外泌體的功能外泌體可能作為細胞之間物質和信號通訊的途徑，不同的細胞通過分泌攜帶不同組分的外泌體實現細胞間通訊，這些外泌體被受體細胞吸收，通過物質交換或釋放內含物實現物質和信號的交流。外泌體與受體細胞的信息交流可能通過以下4種途徑實現:外泌體表面膜蛋白質被目的細胞表面的受體識別，從而靶細胞;外泌體在蛋白酶作用下產生的表面膜蛋白質碎片可作為目的細胞表面受體的配體;外泌體脂膜可以與目的細胞膜融合，將蛋白質和RNA等內容物釋放進去，此類膜融合可能改變靶細胞的一些膜特性，例如脂質和膜蛋白質的密度及種類;目的細胞通過胞吞的形式攝入外泌體經由以上幾種途徑，外泌體將其攜帶的生物信息運輸到周邊靶細胞或經血液等體液運輸而被遠處組織細胞攝取，進而影響目的細胞的基本功能和基因表達。幾乎所有的細胞都可以在自發或在一定刺激條件下產生外泌體，不同的細胞產生的外泌體具有不同的功能，這些外泌體參與了一系列生理和病理過程，如發生與發展、抗原呈遞、免疫調節、組織愈合等。此外，外泌體與疾病的研究表明：外泌體可能在代謝性疾病的出現以及心血管健康中發揮作用。干貨分享｜選對實驗室常用培養基DMEM和1640。湖南疾病科研技術服務外包

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    2）固定的目的①保持其原有狀態：使細胞內的蛋白質、脂肪、糖、酶等成分轉變為不溶性物質，迅速防止、細胞的死后變化，防止自溶與，防止細胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態結構，使之盡量保持生前的狀態和結構。②以便染色后易于鑒別和觀察：不同成分對染料有不同的親和力，以便染色后易于鑒別和觀察。③使塊硬化，便于制作薄片（塊在脫水、包埋、切片、染色等過程中不易損壞）。（3）固定液固定液種類：一類是單純固定液，即只有一種試劑；另一類是混合固定液，由兩種或兩種以上試劑組成。作為較好的固定液，應有下列特性，首先，有強滲透力，能迅速的滲入內部；其次，不使過度收縮或膨脹，并能使內欲觀察的成分得以凝固為不溶性物質；能使達到一定的硬度并獲得較佳的折光率和對某些染料具有較強的親和力。固定液通常使用10%的甲醛溶液。特殊要求的，常需要特殊的固定液，取樣之前應做好準備。如眼球樣本應使用FAS眼球固定液，脂肪應使用脂肪固定液等。此外，在進行骨樣本制備的時候，還應注意提前進行脫鈣處理，可根據具體情況選擇慢脫鈣或快脫鈣處理。總的來說，樣品的采集是實驗中至關重要的一環，如果取樣環節出現了偏差，往往會導致后續檢測結果的偏移。天津豚鼠科研技術服務服務