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顯微熒光壽命成像原理

來源: 發布時間:2022-07-11

熒光分析和成像技術因具有非常高的靈敏度和分子特異性而普遍的應用于生物物理、生物化學、醫學、物理、化學等領域,利用熒光光譜技術和熒光顯微技術可以分析樣品中熒光團的組分和分布。不過,由于熒光分析技術大多是基于熒光強度的測量,容易受到激發光強度、樣品濃度淬滅、熒光染料的分布濃度等因素的影響。熒光壽命通常來講是一定的,不受激發光強度、熒光團濃度等因素的影響,只只與熒光團所處的微環境有關,因此,利用熒光壽命顯微鏡(Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)對樣品進行熒光壽命成像,可以對樣品所在的微環境中的許多物理參數如氧壓、溶液疏水性等及生物化學參數如pH值、離子濃度等進行定量測量。此外,熒光壽命成像技術還可以同時獲得分子狀態和空間分布的信息。熒光壽命是微環境的相對參數,不受環境吸收、樣本濃度等因素影響。顯微熒光壽命成像原理

熒光壽命成像系統是一種用于化學領域的分析儀器,熒光壽命成像可以在體現熒光物質形貌信息之外,還能夠靈敏地反應熒光基團生化特性以及周圍微環境的變化情況。將熒光壽命成像與共聚焦成像技術結合起來,實現人體三維熒光壽命成像,進一步實現人體三維功能成像奠定基礎,有潛力應用于瘤識別,病變診斷等領域。熒光壽命是熒光基團在通過發射熒光光子返回基態之前在其激發態下保持平均多長時間的量度。不同熒光基團激發態停時間不同,大多數生物熒光素的熒光壽命時間在 0.2 - 20 ns。熒光壽命檢測經典方法為點對點的時間相關單光子計數(TCSPC),但由于過去檢測硬件的局限和復雜的使用而沒有被普遍地應用于科學研究。隨著技術的發展,在顯微鏡視野內進行超快速全像素熒光壽命信號采集的熒光壽命成像成為可能。天津生物熒光壽命成像哪家實惠熒光壽命成像(FLIM)對細胞信號傳導及調控,蛋白間的相互作用等生物研究發揮著很大作用。

熒光壽命成像有幾點優勢:1.不需要考慮跳色的影響,從而免去了計算和去除跳色雜質信號的麻煩;去除跳色雜質的準確性很大程度上依賴于信噪比、成像流程的設計和控制、以及跳色信號估算的算法,這些因素使得通過穩態光強度測量熒光壽命成像的精確度在很多時候受到質疑。2.穩態光強度的熒光壽命成像測量很容易受熒光標記光漂白或是激發光散射背景的影響,而這些因素對FLIM-FRET的測量影響相對較低。3.熒光壽命成像可以定量的區分參與FRET和沒有參與FRET的分子數量,這樣深入的定量分析是穩態光強度方法做不到的。

熒光壽命成像開始用于組織體的在體成像,與傳統的使用熒光強度和光譜信息作為鑒別組織異常的成像方式相比,壽命成像提供了更多的生化診斷信息。熒光壽命成像已用于骨骼和牙齒的診斷。另外,采用多光子激發可顯著提高組織體的成像深度,如對人體皮膚自體熒光進行多光子激發熒光壽命成像,成像深度達200 um,組織體的熒光壽命分布揭示了細胞代謝狀態的變化,可用于對皮膚病的診斷。對腔體中瘤的早期臨床診斷,已開發出具有實時及壽命分辨功能的內窺鏡,并對離體膀胱樣品進行測試,得到了黃素分子的自體熒光壽命圖像。熒光壽命可以在頻域或者時間域測量。

作為熒光成像中除光譜和強度之外的新維度,當前,熒光壽命成像主要應用領域包括:用于樣品分離,如利用不同染料熒光壽命的差異將不同組織、正常與病變細胞等有效分離。熒光壽命成像可以提供熒光強度(光子數)和光子壽命的空間分布,具有200 nm的空間分辨率和皮秒量級的時間分辨率。通過雙光子激發可以直接檢測熒光和時間分辨的熒光壽命。這種無損檢測技術,無需解剖或專門制造分層樣品,不但可在樣品表面,還可在樣品表面以下實現深度解析測量。特別適用于新材料、光子學、光伏、光催化、生物材料、納米材料和納米復合材料以及其相關的原理探究和設計優化。在種類繁多的顯微技術中,熒光壽命顯微成像技術被普遍地應用于生物學研究及臨床診斷等領域。顯微熒光壽命成像多少錢

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熒光壽命成像 (FLIM)通過建立檢測到的熒光事件的直方圖來確定壽命。可顯示單指數或多指數熒光衰減。數值曲線擬合表示熒光壽命和振幅(即檢測到的光子數)。由于FRET減少了供體壽命,因此如果無FRET的供體壽命已知,就可以量化FRET發生的程度。該供體壽命τ作為分析FRET樣品的一定參考。因此,FLIM-FRET為內部參照—這一特點減少了基于強度測量FRET時的很多缺點。由于其熒光壽命是染料的固有特性,因此對其他不利影響(如光漂白、圖像明暗處理、不同濃度或表達水平)具有普遍的不變性。使用基于強度的FRET測量的主要限制是所有可觀察的供體分子都經歷FRET的基本假設。通常情況并非如此。供體分子這種變化的“非結合”組分給測量的FRET效率帶來了相當大的不確定性,使得無法在實驗之間進行比較。熒光壽命成像克服了這一缺點。顯微熒光壽命成像原理

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